乳腺癌患者CYP2D6基因多態(tài)性與他莫昔芬代謝相關性研究

陳艷波 孔德嘉 張金鋒 馬志剛

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。大約60%的乳腺癌患者為雌激素受體陽性(Estrogen-receptor positive，ER+)的患者，該類乳腺癌依賴雌激素信號刺激腫瘤生長[2]。他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)作為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，可以通過對抗腫瘤細胞中的雌激素受體來抑制腫瘤細胞增殖，從而提高乳腺癌患者的生存率[3-4]。在以往的臨床治療中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者對他莫昔芬的反應性存在很大的個體差異，部分患者可能出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[5]。但是目前仍然缺少敏感的生物學標志物來預測他莫昔芬的療效。

已有研究表明，CYP2D6的基因多態(tài)性與他莫昔芬在患者體內(nèi)的代謝和療效明顯相關。因此，本研究在當前的研究中探索CYP2D6的三種基因多態(tài)性(rs16947，rs1065852，rs28371725)與他莫昔芬三種代謝產(chǎn)物在患者血液中濃度的相關性，希望本研究能夠為后續(xù)預測他莫昔芬療效提供科學依據(jù)，從而更加科學的指導臨床患者用藥。

1 材料與方法

1.1 研究人群

本研究選取2010年1月—2012年12月在哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科就診的乳腺癌患者198例，這些患者均通過病理診斷確診為乳腺癌，并且這些患者在術后應用他莫昔芬進行內(nèi)分泌治療。經(jīng)醫(yī)生和患者同意后，對病人進行術前采集血液樣本，并對血液樣本進行下一步檢測。

1.2 研究方法

1.2.1 熒光定量PCR基因型鑒定 使用Qiagen公司的DNA提取試劑盒提取外周血DNA，利用NanoDrop2000c儀器定量測定DNA濃度及OD值，質(zhì)量合格的DNA用0.5 mL EP管分裝，-20℃凍存?zhèn)溆?。Taqman探針法基因分型：探針在life technology公司訂購，熒光定量PCR反應體系如表1。

表1 熒光定量PCR體系及條件Table 1 Reaction system and condition of real time PCR

1.2.2 超高液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀檢測他莫昔芬三種代謝產(chǎn)物濃度 定量檢測TAM三種代謝產(chǎn)物的濃度：4-OH-N-D-TAM、4′OH-N-D-TAM、4-OH-TAM。4-OH-TAM的母離子為388.2，子離子為72.1，錐孔電壓為30 V，標準曲線濃度范圍為20、40、80、200和600 ng/mL；4-OH-N-D-TAM、4′OH-N-D-TAM的母離子均為374.3，子離子為129，但是保留時間分別為3.7 min和4.2 min，標準曲線濃度范圍為50、100、200、500、1000和1500 ng/mL。

1.3 實驗質(zhì)量控制

全部實驗在哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院分子流行病學實驗室完成。所有進行基因分型的DNA樣本都通過試劑盒進行提取。實驗操作過程在冰盤上操作完成?；蚍中褪褂昧_氏熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。在每96孔板中隨機選擇1～2個空白對照，每個SNP信號都是在滿足形成三個明顯分型點聚集簇的情況下，完成基因型分析，并給出報告。對于每個SNP位點，隨機選擇5%的樣本進行復測。

1.4 統(tǒng)計方法

運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，用Shapiro-Wilk法對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，不符合正態(tài)分布，選用Kruskal-Wallis秩和檢驗，Wilcoxon秩和檢驗，并進行多重比較檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 液質(zhì)聯(lián)用檢測他莫昔芬代謝產(chǎn)物

他莫昔芬代謝產(chǎn)物4-OH-TAM的標準曲線為y=0.0013x+8.5298，R2=0.998；他莫昔芬其他兩種代謝產(chǎn)物4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM的標準曲線分別為y=0.042x+9.291，R2=0.9995；y=0.0319x+3.115，R2=0.9975。建立的檢測方法具有良好的線性范圍和相關系數(shù)，能夠滿足他莫昔芬代謝產(chǎn)物檢測的需要。

2.2 SNP位點與他莫昔芬代謝產(chǎn)物濃度的關系

不同基因型患者他莫昔芬代謝產(chǎn)物的濃度經(jīng)過Shapiro-Wilk法分析后，P值均小于0.05，不符合正態(tài)分布。因此，以上數(shù)據(jù)需采用非參數(shù)檢驗的獨立樣本Kruskal-Wallis秩和檢驗Wilcoxon秩和檢驗進行分析，并用中位數(shù)和變異區(qū)間進行描述(表2-4)。

2.3 各SNP位點不同基因型攜帶者他莫昔芬藥物代謝濃度的差異

rs16947位點三種基因型之間相比，應用他莫昔芬后產(chǎn)生的4-OH-TAM的濃度并無統(tǒng)計學差異(P=0.704)，而4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM的濃度均具有統(tǒng)計學差異(P=0.049)。對4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM兩種代謝產(chǎn)物在各基因型組間的差異進行兩兩比較，經(jīng)多重檢驗校正后發(fā)現(xiàn)，純合變異型和純和野生型之間相比，代謝產(chǎn)物濃度具有統(tǒng)計學差異(P=0.014)，AG及GG基因型之間相比，同樣具有統(tǒng)計學差異(P=0.008)。以上結果表明該位點不同基因型與代謝產(chǎn)物4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM在血液中濃度有關，因此該SNP位點可能參與了患者他莫昔芬的代謝過程(表5)。

此外，rs1065852位點和rs28371725位點上的變異與代謝產(chǎn)物4-OH-N-D-TAM、4′OH-N-D-TAM和4-OH-TAM的含量均無統(tǒng)計學差異，表明這些SNP位點的多態(tài)性并未參與他莫昔芬的代謝過程。

表2 rs16947不同基因型攜帶者他莫昔芬代謝產(chǎn)物的濃度(ng/mL)Table 2 The metabolites concentrations(ng/mL)of Tamoxifen in different genotypes of rs16947(ng/mL)

Note：*Pvalue stands for normality test，P<0.05 does not conform to normal distribution.

表3 rs1065852不同基因型攜帶者他莫昔芬代謝產(chǎn)物的濃度(ng/mL)Table 3 The metabolites concentrations(ng/mL)of Tamoxifen in different genotypes of rs1065852(ng/mL)

Note：*Pvalue stands for normality test，P<0.05 does not conform to normal distribution.

表4 rs28371725不同基因型攜帶者他莫昔芬代謝產(chǎn)物的濃度(ng/mL)Table 4 The metabolites concentrations(ng/mL)of Tamoxifen in different genotypes of rs28371725(ng/mL)

Note：*Pvalue stands for normality test，P<0.05 does not conform to normal distribution.

表5 rs16947不同基因型間他莫昔芬代謝產(chǎn)物濃度的比較分析Table 5 The correlation among the metabolites concentrations(ng/ml)of Tamoxifen in different genotypes of rs16947

3 討論

內(nèi)分泌治療是ER陽性乳腺癌患者治療的重要組成部分，他莫昔芬作為內(nèi)分泌治療藥物已有30年的歷史，現(xiàn)在仍然是該亞型患者輔助治療的標準藥物，可以降低患者復發(fā)和死亡風險。在臨床治療過程中，僅僅約50%的患者對他莫昔芬治療有所獲益，嚴重影響了患者的預后。他莫昔芬的代謝過程在肝臟中進行，經(jīng)過P450 3A4/5和CYP2D6介導，形成N-去甲基TAM(N-desmethyl tamoxifen，NDM-TAM)，4-羥基TAM(4-Hydroxy tamoxifen，4-OH-TAM)和4-羥基-N-去甲基TAM(4-Hydroxy-desmethyl tamoxifen，4-OH-N-D-TAM)三種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物與ER的親和力明顯提高，可以更顯著的抑制ER陽性乳腺癌細胞的增殖[6-8]。

CYP2D6是他莫昔芬代謝過程中的一種關鍵酶，研究顯示，CYP2D6存在約100種基因突變位點，這些突變與他莫昔芬代謝活性明顯相關，進而導致乳腺癌患者對他莫昔芬反應出現(xiàn)明顯差異[9-11]。根據(jù)CYP2D6等位基因的不同變異和組合，將患者分為4組代謝表型：低代謝型(Poor metabolizers，PMs)、中間代謝型(Intermediate metabolizers，IMs)、泛代謝型(Extensive metabolizers，EMs)和超速代謝型(Ultrarapid metabolizers，UMs)[12]。有研究表明，給予乳腺癌細胞他莫昔芬時，活性代謝產(chǎn)物4-OH-N-D-TAM的濃度在IMs和EMs中比較高，其對乳腺癌細胞的抑制效果也更好[13]。因此，CYP2D6不同位點的變異可以影響他莫昔芬的活性和療效。

CYP2D6基因多態(tài)性個體差異顯著，歐美國家最常見的是CYP2D6*4，而亞洲人群最主要的變異體為CYP2D6*10[14]。研究表明CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*6的雜合子或純合子可以影響乳腺癌患者4-OH-N-D-TAM的濃度[15]。Xu等發(fā)現(xiàn)攜帶CYP2D6*10等位基因*10/*10的患者，其血中4-OH-N-D-TAM的水平較低[16]。

多項研究表明，CYP2D6基因多態(tài)性與他莫昔芬的體內(nèi)代謝相關，進而可能會對乳腺癌患者的生存產(chǎn)生影響，但由于研究位點不同，研究結果間存在一定的爭議。如Okishiro等[17]分析發(fā)現(xiàn)CYP2D6基因多態(tài)性與乳腺癌患者的無病生存率無相關性，Rae也得到了相似的結果，對他莫昔芬治療的乳腺癌患者隨訪10年，結果表明CYP2D6基因型與患者無病生存率無相關性[18]。而一項Meta分析表明，在使用他莫昔芬的乳腺癌患者中，不同的CYP2D6基因型會影響患者的生存[19]。因此，進行大樣本、多中心的研究可能會為臨床用藥提供更可靠的依據(jù)。

我國乳腺癌疾病的現(xiàn)狀表明，雌激素受體陽性的患者占所有乳腺癌患者的60%～70%，針對雌激素受體陽性的患者進行的內(nèi)分泌治療，成為全身治療的重要手段，他莫昔芬可以廣泛應用于雌激素受體陽性的患者，因此，近年來針對于CYP2D6基因多態(tài)性與他莫昔芬代謝及療效的研究受到了廣泛的關注。由于CYP2D6活性下降，有可能引起他莫昔芬療效下降，針對當前實驗，研究CYP2D6與該基因SNP位點的相關性就變得尤為重要。本實驗分析了乳腺癌患者CYP2D6三個SNP位點(rs16947，rs1065852，rs28371725)基因型和他莫昔芬血液中藥物代謝產(chǎn)物濃度之間的關系。實驗結果表明，CYP2D6基因的SNP rs16947與4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM在血液中的濃度相關。因此，該位點可能參與了他莫昔芬在體內(nèi)代謝的過程，在乳腺癌患者使用他莫昔芬前，檢測分析CYP2D6基因型以及其相應的代謝類型，預測他莫昔芬的療效，對指導臨床患者他莫昔芬用藥具有重要意義。

目前關于CYP2D6基因與ER陽性乳腺癌患者他莫昔芬治療的預后尚存爭議，所以，需要針對大樣本量及長期隨訪的實驗數(shù)據(jù)，分析其對患者預后的影響，以期望能夠指導ER陽性乳腺癌患者進行精準的內(nèi)分泌治療，提高患者的內(nèi)分泌治療效果。