微波協(xié)同L-phe處理對(duì)萌發(fā)苦蕎中主要營(yíng)養(yǎng)成分的影響

馬 輝，卞紫秀，陳雪怡，儲(chǔ) 鈺，王順民

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

苦蕎麥(FagopyrumtataricumGaertn.)富含蘆丁和槲皮素等黃酮類化合物[1]，具有很好的抗氧化、抗炎癥和抗癌癥等作用[2-4]，是一種藥食兩用的重要作物。長(zhǎng)期食用苦蕎對(duì)軟化血管、降血糖、降血脂、降血壓和增強(qiáng)人體免疫力具有積極作用[5-6]。近年來(lái)，大量研究表明，采用微波[7]、激光[8]、超聲波[9]和磁場(chǎng)[10]等物理方法處理種子能夠?qū)ζ涿劝l(fā)過(guò)程產(chǎn)生一定的誘導(dǎo)效應(yīng)和生物效應(yīng)。微波是一種電磁波，對(duì)種子進(jìn)行輻照能夠產(chǎn)生大量的熱量[11]，使種子內(nèi)部蛋白質(zhì)和淀粉的分子結(jié)構(gòu)改變[12]，從而影響種子在萌發(fā)過(guò)程中的生理生化性狀。Maqueda[13]和Audrius[14]的研究證實(shí)，微波能夠提高植物種子的萌發(fā)率與芽苗的活力。除此之外，適當(dāng)?shù)奈⒉ㄝ椪者€能夠顯著增加游離氨基酸、還原糖、總酚及總黃酮的積累量[7,15]。因此，微波輻照對(duì)增加苦蕎種子、芽苗的活力與芽苗中營(yíng)養(yǎng)成分的富集具有重要意義。

苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)屬于芳香族氨基酸，是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的氨基酸之一。作為苯丙烷代謝的前體物質(zhì)，連接著初級(jí)代謝和苯丙烷類次級(jí)代謝，對(duì)植物的初級(jí)代謝及苯丙烷代謝起著重要作用[16]。研究表明，使用適量的外源Phe處理能夠刺激苦蕎芽苗中碳水化合物、總酚[17]和黃酮類物質(zhì)[18]的積累量的增加。Ozturk[19]采用HPLC分析表明，添加外源L-phe能夠誘導(dǎo)沒(méi)食子酸、反式肉桂酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸等酚類化合物的積累量顯著增加。Seo[20]證實(shí)，5 mM的外源L-phe處理對(duì)酚類化合物積累的促進(jìn)效應(yīng)最佳，同時(shí)，苯丙烷類代謝途徑中CHI和FLS兩種酶的基因表達(dá)量也顯著增加。Md-Mustafa[21]表明，外源Phe處理下，總酚和總黃酮積累量的增加是由于刺激了苯丙烷類代謝途徑中苯丙氨酸解氨酶和查爾酮合成酶基因的表達(dá)。因此，通過(guò)添加適量L-phe來(lái)調(diào)控苦蕎萌發(fā)過(guò)程中多種營(yíng)養(yǎng)成分的合成是一種科學(xué)有效的方法。

目前關(guān)于采用微波和外源Phe分別處理種子萌發(fā)的研究較多，而關(guān)于微波協(xié)同外源Phe處理對(duì)苦蕎萌發(fā)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分變化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)研究不同微波處理對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響，在萌發(fā)率實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究微波條件協(xié)同不同摩爾濃度的外源L-phe處理對(duì)苦蕎麥種子在萌發(fā)過(guò)程中總酚、總黃酮、還原糖及可溶性總糖含量的影響，為進(jìn)一步探究苦蕎麥萌發(fā)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分變化規(guī)律及深入開(kāi)發(fā)利用苦蕎提供一定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

苦蕎麥(購(gòu)自四川涼山);L-phe、蘆丁、Al(NO3)3、硫代巴比妥酸、3,5-二硝基水楊酸均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

光照種子發(fā)芽箱(YRG-150，上海臺(tái)恒儀器設(shè)備有限公司)；風(fēng)力懸浮微波爐(P7021TP-6，安徽工程大學(xué)食品系-蕪湖眾維教研儀器研發(fā)公司聯(lián)合開(kāi)發(fā))；醫(yī)用離心機(jī)(TGL-16A，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(LGJ-12，北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。

1.2 處理及培養(yǎng)

選取顆粒飽滿的苦蕎種子，1 g/L KMnO4消毒5 min，室溫下使用蒸餾水浸泡4 h(每2 h換水一次)，后置于55 ℃水浴中催芽15 min。催芽結(jié)束使種子冷卻至室溫，再按照下述方法進(jìn)行處理。

(1)微波處理對(duì)萌發(fā)率的影響：分別采用400 W 10 s、400 W 30 s、600 W 10 s和600 W 30 s的微波條件處理苦蕎種子。以蒸餾水為培養(yǎng)液，將苦蕎種子置于光照培養(yǎng)箱(設(shè)置溫度為25 ℃，濕度為80%)內(nèi)避光培養(yǎng)，每12 h測(cè)定各組苦蕎種子的萌發(fā)率。

(2)L-phe處理對(duì)苦蕎種子的影響：以蒸餾水作為培養(yǎng)液，將苦蕎種子置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)至露白(1.5 d)后，分別采用1 mM、3 mM、5 mM、7 mM和9 mM的L-phe對(duì)苦蕎種子進(jìn)行培養(yǎng)。

(3)微波協(xié)同L-phe處理對(duì)苦蕎種子的影響：采用微波(在萌發(fā)率實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上)預(yù)先處理苦蕎種子，然后以蒸餾水作為培養(yǎng)液，將苦蕎種子置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)至露白后，采用不同摩爾濃度的L-phe培養(yǎng)苦蕎種子。

從苦蕎種子露白后開(kāi)始，培養(yǎng)至第7 d，每12 h換1次新鮮培養(yǎng)液。采收發(fā)芽1 d、3 d、5 d和7 d的長(zhǎng)勢(shì)均勻的苦蕎芽苗，冷凍干燥后備用。以未經(jīng)微波與L-phe處理的種子作為對(duì)照組，每個(gè)水平做3次重復(fù)。

1.3 總酚含量的測(cè)定(Folin-Phenol比色法)

稱取0.2 g苦蕎于研缽中，加入石英砂磨粉。每組的樣品凍干粉中加入5 mL 60%乙醇溶液，在超聲波中水浴浸提30 min(60 ℃)后，于8 000 r/min離心10 min，取上清液至10 mL容量瓶并定容至刻度，備用。參照Ling[22]的方法，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。

1.4 總黃酮含量的測(cè)定(硝酸鋁顯色法)

稱取0.2 g苦蕎干樣于研缽中粉碎，加入5 mL 60%乙醇溶液，置于超聲波中水浴浸提30 min(60 ℃)后，于9 000 r/min離心15 min，取上清液至10 mL容量瓶并定容至刻度，備用。參照Ling[22]的方法，在502 nm下測(cè)定吸光度并根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量。

1.5 還原糖含量的測(cè)定(DNS法)

采用高俊鳳[23]的方法制備粗糖上清液。取2 mL上清液(剩余上清液用作可溶性總糖含量的測(cè)定)于試管中，加入2 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，立即用流水冷卻至室溫，最終移液至25 mL容量瓶中并定容至刻度，搖勻后于540 nm下測(cè)定吸光度并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖的含量。

1.6 可溶性總糖含量的測(cè)定(蒽酮-H2SO4法)

采用高俊鳳[23]的方法：取1.5中測(cè)定還原糖剩余的上清液1 mL，置于10 mL容量瓶中并定容，取2 mL至試管中，在冰水浴下沿管壁緩慢加入蒽酮-H2SO4試劑，搖勻后置于沸水浴中準(zhǔn)確加熱10 min，待反應(yīng)結(jié)束后立即用流水冷卻至室溫，在波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定吸光值并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶性總糖的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)是將3次重復(fù)的結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)其進(jìn)行One-way方差分析(ANOVA)，采用SigmaPlot 10.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響

不同微波處理下苦蕎種子萌發(fā)率的變化如圖1所示。由圖1可知，隨著萌發(fā)時(shí)間的增加，苦蕎種子的萌發(fā)率在24～48 h快速增加，待萌發(fā)至72 h后，所有處理組和對(duì)照組的萌發(fā)率均趨于穩(wěn)定。萌發(fā)24 h，400 W 10 s的微波處理組的萌發(fā)率最高達(dá)11.67%，相比對(duì)照組增加了52.15%。隨著萌發(fā)時(shí)間的增加(24～60 h)，400 W 10 s的微波處理組的萌發(fā)率均高于其他處理組與對(duì)照組，當(dāng)萌發(fā)至108 h，該處理組的萌發(fā)率達(dá)到95.33%，與所有處理組及對(duì)照組無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，400 W的微波功率處理10 s能夠明顯提高苦蕎種子在萌發(fā)初期的萌發(fā)率(微波協(xié)同L-phe的處理步驟中均采用400 W 10 s的微波條件進(jìn)行處理)，而對(duì)種子的最終萌發(fā)率影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 不同微波處理下苦蕎種子萌發(fā)率的變化

2.2 微波協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理對(duì)萌發(fā)苦蕎中總酚含量的影響

微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中總酚含量的變化如圖2所示。由圖2可知，萌發(fā)1～3 d內(nèi)，隨著萌發(fā)時(shí)間的增加芽苗中總酚含量逐漸增加，萌發(fā)5 d時(shí)，芽苗中總酚含量最高，而當(dāng)萌發(fā)至第7 d時(shí)，總酚含量有所下降。在萌發(fā)5 d的芽苗中總酚含量變化規(guī)律表現(xiàn)為隨著L-phe摩爾濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)L-phe的摩爾濃度為5 mM時(shí)，芽苗中總酚含量最高達(dá)23.11 mg/g，相比對(duì)照組增加了16.95%。當(dāng)采用微波處理(400 W 10 s)協(xié)同L-phe(5 mM)處理時(shí)，萌發(fā)5 d的芽苗中總酚含量相對(duì)L-phe處理(5 mM)降低了3.68%，而萌發(fā)7 d的芽苗中總酚含量繼續(xù)增加達(dá)23.33 mg/g，相比對(duì)照組增加了38.37%，得到萌發(fā)7 d內(nèi)最高的總酚積累量。結(jié)果說(shuō)明，采用適當(dāng)?shù)谋奖轭惔x前體物質(zhì)[16]L-phe處理(1～7 mM)能夠明顯提高苦蕎種子萌發(fā)過(guò)程中總酚的積累量，且在微波(400 W 10 s)與L-phe(5 mM)的協(xié)同處理下，能夠獲得更高的總酚積累量，這可能與苯丙烷類代謝途徑中CHI和FLS兩種酶基因表達(dá)量的增加密切相關(guān)[20]。

圖2 微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中總酚含量的變化

2.3 微波協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理對(duì)萌發(fā)苦蕎中總黃酮含量的影響

微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中總黃酮含量的變化如圖3所示。由圖3可知，隨著萌發(fā)時(shí)間的增加，苦蕎芽苗中總黃酮含量逐漸增加。當(dāng)采用不同摩爾濃度的L-phe處理時(shí)，芽苗中總黃酮含量隨著L-phe摩爾濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。其中，7 mM L-phe處理下萌發(fā)7 d的苦蕎芽苗中總黃酮的積累量最高達(dá)4.84 g/100 g，相比對(duì)照組增加了28.38%。而當(dāng)采用微波協(xié)同L-phe處理(5 mM)時(shí)，萌發(fā)7 d的芽苗中總黃酮的積累量達(dá)到5.10 g/100 g，相比對(duì)照組及L-phe處理組(5 mM)分別增加了35.28%和5.37%。結(jié)果說(shuō)明，一定摩爾濃度的L-phe處理(1～7 mM)對(duì)苦蕎種子中總黃酮的積累具有促進(jìn)效應(yīng)，且一定微波處理(400 W 10 s)協(xié)同一定摩爾濃度的L-phe處理(5 mM)對(duì)總黃酮積累的促進(jìn)效應(yīng)更佳。

圖3 微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中總黃酮含量的變化

2.4 微波協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理對(duì)萌發(fā)苦蕎中還原糖含量的影響

微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中還原糖含量的變化如圖4所示。由圖4可知，苦蕎芽苗中還原糖含量隨著萌發(fā)時(shí)間的增加而不斷增加，當(dāng)萌發(fā)至5 d時(shí)，還原糖含量開(kāi)始出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在L-phe處理的萌發(fā)5 d的芽苗中，采用5 mM L-phe處理的芽苗中還原糖含量達(dá)5.20 g/100 g，明顯高于其他摩爾濃度的L-phe處理組及對(duì)照組。當(dāng)采用微波處理(400 W 10 s)協(xié)同L-phe處理(1～7 mM)時(shí)，5 d的芽苗中還原糖含量相比單獨(dú)采用L-phe處理的芽苗明顯增加。有趣的是，在微波協(xié)同L-phe處理下，7 d的芽苗中還原糖含量相比第5 d繼續(xù)增加，當(dāng)L-phe的摩爾濃度為5 mM時(shí)，芽苗中還原糖含量最高達(dá)6.56 g/100 g，相比對(duì)照組增加了59.61%，這可能與微波輻照改變了淀粉的分子結(jié)構(gòu)而加速其向小分子碳水化合物轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[12]。結(jié)果說(shuō)明，一定摩爾濃度的L-phe處理(1～5 mM)能夠有效促進(jìn)苦蕎芽苗中還原糖含量的增加，而采用一定條件的微波刺激(400 W 10 s)后再使用一定摩爾濃度的L-phe處理(1～7 mM)能夠更好地促進(jìn)苦蕎芽苗中還原糖含量的增加。

圖4 微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中還原糖含量的變化

2.5 微波協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理對(duì)萌發(fā)苦蕎中可溶性總糖含量的影響

微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中可溶性總糖含量的變化如圖5所示。由圖5可知，萌發(fā)1～5 d內(nèi)，苦蕎芽苗中可溶性總糖含量隨著萌發(fā)時(shí)間的增加不斷增加，而萌發(fā)5～7 d內(nèi)，其含量增加速度緩慢。在萌發(fā)7 d的芽苗中，L-phe處理(1～7 mM)對(duì)可溶性總糖的積累表現(xiàn)出了一定的促進(jìn)效應(yīng)，且隨著其摩爾濃度的增加可溶性總糖含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，其中，5 mM的L-phe處理的芽苗中可溶性總糖含量最高達(dá)13.07 g/100 g，比對(duì)照組增加了10.86%。由圖5a、圖5b、圖5c和圖5d中均可看出，經(jīng)微波預(yù)先處理的苦蕎種子在萌發(fā)過(guò)程中可溶性總糖含量相比未經(jīng)微波處理有明顯的增加趨勢(shì)。當(dāng)采用微波協(xié)同5 mM的L-phe處理時(shí)，7 d的芽苗中可溶性總糖最高達(dá)15.11 g/100 g，比對(duì)照組和L-phe處理組(5 mM)分別增加了28.16%和15.61%。結(jié)果說(shuō)明，微波處理(400 W 10 s)和L-phe處理(1～7 mM)對(duì)苦蕎芽苗中的可溶性總糖含量的增加均具有一定促進(jìn)效應(yīng)，且微波(400 W 10 s)協(xié)同L-phe處理(1～9 mM)對(duì)芽苗中可溶性總糖含量積累的促進(jìn)效應(yīng)更佳。

圖5 微波協(xié)同L-phe處理下萌發(fā)苦蕎中可溶性總糖含量的變化

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)前期研究了微波功率對(duì)苦蕎種子萌發(fā)率的影響，結(jié)果表明，采用400 W的微波功率處理10 s能夠有效提高苦蕎種子在萌發(fā)初期的萌發(fā)率。Wang[7]的研究表明，600 W的微波功率輻射10 s對(duì)苦蕎種子的萌發(fā)率提升最高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在不同之處是由于選用的苦蕎種子的產(chǎn)地有所差異。采用400 W 10 s的微波條件協(xié)同不同摩爾濃度的L-phe處理，研究了苦蕎種子萌發(fā)過(guò)程中主要成分的變化規(guī)律，結(jié)果表明：微波處理(400 W 10 s)能夠提高萌發(fā)苦蕎中總酚、還原糖和可溶性總糖的含量。一定L-phe處理(1～7 mM)能夠提高萌發(fā)苦蕎中總酚、總黃酮的積累量；一定L-phe處理(1～5 mM)能夠提高萌發(fā)苦蕎中還原糖和可溶性總糖的含量。微波(400 W 10 s)協(xié)同一定L-phe處理(5 mM)對(duì)萌發(fā)苦蕎中總酚、總黃酮、還原糖和可溶性總糖含量的積累具有較好的促進(jìn)效應(yīng)，在此條件下萌發(fā)7 d的苦蕎芽苗中4種成分的含量達(dá)到最高。研究為苦蕎麥萌發(fā)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分富集方面的研究及深入開(kāi)發(fā)利用苦蕎提供了一定理論基礎(chǔ)。