雄激素受體、腫瘤抑制蛋白P53在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

劉現(xiàn)義，李 中，王曉春，史鴻云，游冀鵬

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科 071000)

三陰性乳腺癌(TNBC)指人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體(HER-2)、雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)均呈陰性的乳腺癌[1]。TNBC具有癌組織細(xì)胞分化程度較低、組織學(xué)分級(jí)較高等特點(diǎn)，且對(duì)分子靶向治療不敏感，難以建立有效治療方案，導(dǎo)致TNBC復(fù)發(fā)率和病死率較高[2]。雄激素受體(AR)屬類(lèi)固醇激素受體，對(duì)細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)通路具有調(diào)節(jié)作用。腫瘤抑制蛋白p53(P53)是一種蛋白質(zhì)，由抑癌基因表達(dá)產(chǎn)生，具有抑制DNA復(fù)制及細(xì)胞惡性增殖等作用。有研究[3-4]指出TNBC患者預(yù)后與AR、P53表達(dá)情況關(guān)系密切。本研究采取回顧性分析，以2013年1月至2014年1月于本院接受治療的乳腺癌患者臨床資料為研究對(duì)象，探討AR、P53在TNBC中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年1月至2014年1月于本院接受治療的130例乳腺癌患者，其中手術(shù)病理確診TNBC患者32例(TNBC組)，另選取同期于本院手術(shù)病理確診的32例非三陰性乳腺癌(NTNBC)患者作對(duì)照(NTNBC組)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)HER-2、ER及PR均呈陰性；(2)就診時(shí)遠(yuǎn)處臟器無(wú)轉(zhuǎn)移；(3)未接受新輔助化療，均接受手術(shù)治療；(4)臨床資料完整，包括基線(xiàn)資料、病理診斷、治療方式等；(5)隨訪(fǎng)資料完整，包括轉(zhuǎn)移時(shí)間及部位、死亡事件等；(6)患者均自愿且簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重感染性疾病或呼吸、血液、肝腎等原發(fā)性疾病者；(2)臨床資料或隨訪(fǎng)資料不全者。

1.2檢測(cè)方法 于手術(shù)中收集患者癌組織標(biāo)本，置于10%甲醛中固定并制作石蠟包埋塊。(1)AR：①將所有患者的石蠟包埋塊進(jìn)行切片，每張切片厚4 μm；②將切片置入60 ℃烤箱內(nèi)120 min進(jìn)行脫臘；③用pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)；④于0.3%過(guò)氧化氫(H2O2)溶液中浸泡10 min以阻斷內(nèi)源化H2O2酶的活性；⑤10%正常血清進(jìn)行封閉，室溫中孵育10 min；⑥滴加AR多克隆抗體，置于4 ℃孵育過(guò)夜；⑦滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育20 min；⑧滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素三抗，37 ℃孵育20 min，行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。(2)P53：①切片、脫蠟及水化流程同AR檢測(cè)；②于檸檬酸溶液中煮沸8 min，保溫10 min；③冷卻后，滴加鼠抗人P53單克隆抗體(上海賓智慧生物)，置于5 ℃孵育；④滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育20 min，行DAB染色。

1.3陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn) 顯微鏡下觀察：(1)細(xì)胞核染色細(xì)胞數(shù)大于10%判定為AR陽(yáng)性[5]；(2)癌細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞大于10%判定為P53陽(yáng)性[6]。

1.4隨訪(fǎng) 隨訪(fǎng)時(shí)間自手術(shù)日期開(kāi)始，至2017年1月為止。無(wú)病生存(DFS)率=隨訪(fǎng)期間內(nèi)未出現(xiàn)疾病相關(guān)性事件(包括轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或死亡)人數(shù)/總?cè)藬?shù)×100%；總生存(OS)率=隨訪(fǎng)期間內(nèi)未發(fā)生死亡事件人數(shù)/總?cè)藬?shù)×100%。隨訪(fǎng)方式包括定期復(fù)查、電話(huà)及信訪(fǎng)。

2 結(jié) 果

2.1臨床病理特征 與NTNBC組比較，TNBC組中組織學(xué)1級(jí)占比明顯更低(χ2=4.947，P<0.05)、組織學(xué)3級(jí)占比明顯更高(χ2=4.433，P<0.05)。兩組年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2AR、P53在TNBC和NTNBC患者中的表達(dá) TNBC組中AR陽(yáng)性表達(dá)率較NTNBC組明顯降低(P<0.05)；P53陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于NTNBC組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3AR、P53表達(dá)與TNBC臨床病理特征關(guān)系 與組織學(xué)1～2級(jí)者比較，TNBC組中組織學(xué)3級(jí)者AR陽(yáng)性表達(dá)率明顯下降(P<0.05)，P53陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高(P<0.05)。與TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期者比較，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期者AR陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低(P<0.05)，P53陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)明顯增加(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者AR陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，但P53表達(dá)與TNBC患者淋巴轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)。腫瘤直徑大于或等于2 cm者P53陽(yáng)性表達(dá)率較腫瘤直徑小于2 cm者明顯升高(P<0.05)，但AR表達(dá)與TNBC患者腫瘤直徑無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)。AR和P53表達(dá)與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)均無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.4AR、P53表達(dá)與TNBC患者預(yù)后的關(guān)系 TNBC患者中隨訪(fǎng)時(shí)間最短4個(gè)月，最長(zhǎng)36個(gè)月，中位時(shí)間27個(gè)月。其中復(fù)發(fā)8例，DFS最短為2個(gè)月，最長(zhǎng)為36個(gè)月。AR陽(yáng)性表達(dá)者3年DFS率、OS率均高于AR陰性者，3年復(fù)發(fā)率低于AR陰性者，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。P53陽(yáng)性表達(dá)者3年DFS率、OS率均明顯低于P53陰性者，3年復(fù)發(fā)率明顯高于P53陰性者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表1 兩組臨床特征參數(shù)比較[n(%)]

表2 AR、P53在TNBC和NTNBC患者中表達(dá)情況比較[n(%)]

表3 AR、P53表達(dá)與TNBC臨床病理特征關(guān)系[n(%)]

表4 AR、P53表達(dá)與TNBC患者預(yù)后的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

乳腺癌為女性多發(fā)惡性腫瘤之一，其病死率位居女性癌癥之首。近年來(lái)乳腺癌發(fā)病率正以每年4%的速度快速增長(zhǎng)，已嚴(yán)重危害女性健康。TNBC約占乳腺癌的20%，具有侵襲性強(qiáng)、累及淋巴多、常出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等特點(diǎn)[7]。TNBC對(duì)分子靶向或內(nèi)分泌治療不敏感，目前臨床治療以化療為主，但未取得滿(mǎn)意療效；還有學(xué)者針對(duì)抗血管生成抑制劑等腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物探究新的治療手段，但其有效性尚未得到充分驗(yàn)證[8]。本研究通過(guò)分析AR與P53在TNBC中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系，旨在探究AR和P53在TNBC病理生理中的作用機(jī)制，以期為T(mén)NBC治療提供新靶點(diǎn)。

AR與ER、PR均屬類(lèi)固醇激素受體，其中ER和PR既為T(mén)NBC判定指標(biāo)，也是內(nèi)分泌治療的選擇標(biāo)準(zhǔn)；但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)AR在TNBC病理發(fā)展中的作用機(jī)制尚未完全闡明，也未形成相應(yīng)的靶向治療方案。AR由N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、鉸鏈區(qū)、配體結(jié)合區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白等參與細(xì)胞增殖及分化。正常狀態(tài)下AR在細(xì)胞質(zhì)中呈穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)AR與雄激素結(jié)合時(shí)構(gòu)象發(fā)生改變、調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，在乳腺上皮細(xì)胞及普通細(xì)胞中均有表達(dá)，體現(xiàn)出乳腺上皮細(xì)胞具有雄激素應(yīng)答性[9]。劉曉麗等[10]報(bào)道稱(chēng)AR在乳腺癌中表達(dá)率高達(dá)80%左右，屬表達(dá)最廣泛的類(lèi)固醇激素受體，其在NTNBC中表達(dá)率大于70%，在TNBC中表達(dá)率為10%～45%。本研究顯示TNBC組中AR陽(yáng)性表達(dá)率為46.88%，明顯低于NTNBC組(81.25%)，這與蔣威華等[11]研究結(jié)果相似；說(shuō)明TNBC患者AR表達(dá)缺失與乳腺癌惡性表型密切相關(guān)。同時(shí)本研究中AR陽(yáng)性表達(dá)與TNBC患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)和腫瘤直徑均無(wú)明顯相關(guān)性，而與組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均明顯相關(guān)；表現(xiàn)為T(mén)NBC患者中組織學(xué)3級(jí)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者AR陽(yáng)性表達(dá)率較組織學(xué)1～2級(jí)、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者均明顯降低；提示AR陽(yáng)性表達(dá)的TNBC患者癌細(xì)胞增殖活力弱，但分化程度高。且AR陽(yáng)性表達(dá)者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低，說(shuō)明AR陽(yáng)性者不易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與相關(guān)研究[12]結(jié)果一致。究其原因可能為AR可對(duì)癌細(xì)胞增殖起到一定抑制作用，從而有效阻止乳腺原位癌轉(zhuǎn)變?yōu)榻?rùn)性癌。此外本研究顯示TNBC患者中AR陽(yáng)性表達(dá)者3年DFS、OS率，3年復(fù)發(fā)率與AR陰性者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而文獻(xiàn)[13]報(bào)道AR陽(yáng)性表達(dá)的TNBC患者3年DFS、OS率均顯著優(yōu)于陰性表達(dá)者(P=0.047、0.041)。分析原因可能與本研究選取的樣本量相對(duì)較少有關(guān)。1項(xiàng)Meta分析[14]顯示AR陽(yáng)性表達(dá)者DFS及OS較高，AR可作為早期乳腺癌患者的預(yù)后標(biāo)志物。同時(shí)雷雨等[15]報(bào)道亦稱(chēng)對(duì)TNBC患者而言AR陰性可預(yù)測(cè)不良預(yù)后，原因可能為AR表達(dá)缺失可促進(jìn)TNBC患者癌細(xì)胞發(fā)生分級(jí)，從而誘發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生及癌細(xì)胞復(fù)發(fā)，而復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移為乳腺癌致死的重要誘因。

P53蛋白是由位于17號(hào)染色體短臂上的p53基因表達(dá)產(chǎn)生，該基因包括10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子，是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤關(guān)系最緊密的基因，參與了細(xì)胞分化、凋亡、衰老及DNA損傷修復(fù)等重要過(guò)程[16]。p53基因包括野生型和突變型，其中野生型p53基因產(chǎn)生的P53蛋白可保護(hù)DNA免受藥物或射線(xiàn)襲擊，還可起到DNA損傷修復(fù)作用；同時(shí)可對(duì)處于G期的細(xì)胞起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，具體表現(xiàn)為抑制惡性增殖，促使癌變細(xì)胞凋亡，維持正常分化。但野生型P53蛋白半衰期較短，難以通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)到的均為半衰期較長(zhǎng)的突變型P53蛋白。p53基因突變率20%～50%，突變后P53蛋白則失去阻止癌細(xì)胞增殖的作用，突變型P53蛋白可抑制野生型P53蛋白，引起細(xì)胞惡變、轉(zhuǎn)化或凋亡，并誘發(fā)異常有絲分裂，促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生。有研究[17]顯示突變型p53基因過(guò)度表達(dá)常標(biāo)志癌基因的不斷擴(kuò)增，50%～70%乳腺癌患者可出現(xiàn)p53基因突變。本研究顯示TNBC組中P53陽(yáng)性表達(dá)率為71.88%，明顯高于NTNBC組(43.75%)，與楊艷芳等[18]研究一致；說(shuō)明TNBC患者癌細(xì)胞增殖活性更強(qiáng)，但分化能力差。另外本研究中P53表達(dá)與TNBC患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性，而與組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、腫瘤直徑相關(guān)；且組織學(xué)3級(jí)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑大于或等于2 cm者P53陽(yáng)性表達(dá)率較組織學(xué)1～2級(jí)、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤直徑小于2 cm者均明顯降低，這與黃碩等[19]報(bào)道類(lèi)似，提示TNBC患者P53陽(yáng)性表達(dá)時(shí)癌細(xì)胞分化程度低、增殖活力強(qiáng)、侵襲性強(qiáng)，同時(shí)也說(shuō)明P53可能參與了TNBC的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。本研究還發(fā)現(xiàn)中P53陽(yáng)性表達(dá)者3年DFS率、OS率均明顯低于P53陰性表達(dá)者，3年復(fù)發(fā)率明顯高于P53陰性者，說(shuō)明P53陽(yáng)性表達(dá)的TNBC患者更易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。有研究[20]報(bào)道稱(chēng)可將P53作為T(mén)NBC患者預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)及生存的評(píng)判因子。雷珍等[21]研究亦顯示P53貫穿TNBC病理發(fā)展的始終，并可將其作為預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。

綜上所述，TNBC患者中AR陽(yáng)性表達(dá)越高、P53陽(yáng)性表達(dá)越低，預(yù)后較好，AR和P53均參與了TNBC病理過(guò)程，可作為其預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。但對(duì)于AR及P53在TNBC病情進(jìn)展中的具體作用機(jī)制，仍有待臨床更多研究進(jìn)一步論證與分析。