杭白菊提取液對小鼠肝纖維化的保護(hù)作用及機制研究

梁育汝，王彩冰，陳由陽，羅紅葉，屠興榮，唐 敏

(右江民族醫(yī)學(xué)院：1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.應(yīng)用生理研究室，廣西百色 533000)

杭白菊[Dendranthema mori-folium(Ramat)Tzvel，DM]為菊科植物菊的干燥頭狀花序，是常用的中草藥及生活飲品，其性味甘、苦、微寒，歸肺、肝經(jīng)，其主要成分有揮發(fā)油、氨基酸、類黃酮及維生素B等，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒之功效[1]。近年的研究[2-7]發(fā)現(xiàn)，杭白菊有減慢心率、保肝護(hù)心、抑菌抗炎、抗氧化、抗腫瘤、防衰老等功能。杭白菊在肝纖維化方面的干預(yù)少有文獻(xiàn)報道，為此本實驗應(yīng)用四氯化碳(CCl4)建立小鼠肝纖維化模型[8]，采用不同濃度杭白菊提取液給小鼠灌胃，檢測肝組織和血清的生化指標(biāo)和肝組織病理切片，并與臨床用于治療肝病藥物水飛薊賓(用量換算成小鼠用量[9-10])作比較，探討杭白菊對肝纖維化的干預(yù)作用及作用機制，為杭白菊的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級5周齡左右的健康KM小鼠72只，體質(zhì)重(25±2)g，雌雄各半，由右江民族醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供(實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK桂2017-0003；實驗動物使用許可證：SCXK桂2017-0004)，分籠飼養(yǎng)，室溫25 ℃左右，自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.2藥品、試劑及器械 杭白菊(康美藥業(yè)股份有限公司，批號170550751)；CCl4(成都市科龍化工試劑廠，批號20130329)；水飛薊賓膠囊(天津天士力省特制藥有限公司，批號H20040299)；0.9% NaCl注射液(廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號L16062904)；甲醛(煙臺市雙雙化工有限公司，批號20170701)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)酶聯(lián)免疫試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)酶聯(lián)免疫試劑盒、透明質(zhì)酸(HA)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)酶聯(lián)免疫試劑盒、丙二醛(MDA)酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20180105、20180105、20180106、20180106、20180103、20180104)。多功能酶標(biāo)儀(上壹橋國際貿(mào)易有限公司，型號Tristar Lb941)；數(shù)碼顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司，型號BA2100igital)；離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號安亭 TGL-16G)；電子天平(諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司，型號JM-B1003)；三用恒溫水箱(金壇市醫(yī)療儀器廠，型號HH-W600)。

1.3杭白菊提取液的制備 取杭白菊干品300 g，用2 000 mL 30 ℃蒸餾水浸泡30 min，文火煮沸2 h，過濾液文火隔水濃縮至500 mL(相當(dāng)于生藥600 mg/mL)，冷卻后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用時以雙蒸水配成所需濃度的杭白菊提取液。

1.4動物分組與給藥方法 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分為6組。正常對照組和模型對照組灌胃0.9% NaCl注射液，水飛薊賓組灌胃5.5 mg/mL水飛薊賓，杭白菊低、中、高濃度組分別灌胃杭白菊提取液150、300、600 mg/mL；除正常對照組為0.9% NaCl注射液外，其余均為0.1% CCl4；灌胃和腹腔注射用量均按10 mL/kg。各組小鼠先每天灌胃1次連續(xù)1周，接著每天1次的灌胃和腹腔注射隔日交替進(jìn)行4周，再每天灌胃1次連續(xù)1周。末次用藥灌胃前禁食12 h、禁水2 h，在末次用藥灌胃后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.5動物標(biāo)本的制備及肝指數(shù)檢測 末次灌胃30 min后以摘除眼球法采血離心分離血清；迅速剖腹取肝放至電子天平記錄肝濕質(zhì)量(肝指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)，取肝右葉浸泡于10%甲醛溶液固定30 min后，脫水、石蠟包埋、蘇木素-伊紅(HE)染色制成組織切片，通過數(shù)碼顯微鏡檢查各組小鼠肝臟的組織結(jié)構(gòu)并攝像。1.6小鼠血清ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA水平的檢測 取血清，分別用ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，通過酶標(biāo)儀按說明書要求進(jìn)行操作檢測。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清ALT、AST水平和肝指數(shù)的結(jié)果比較 模型對照組和杭白菊低、中、高濃度組的血清ALT、AST水平均明顯高于正常對照組和水飛薊賓組(P<0.01，P<0.05)；水飛薊賓組的血清ALT和AST均與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。杭白菊低、中、高濃度組的血清ALT組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；杭白菊中濃度組的血清AST水平明顯低于杭白菊低和高濃度組(P<0.01)，杭白菊低、高濃度的血清AST水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型對照組、水飛薊賓組和杭白菊低、中、高濃度組的肝指數(shù)之間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均明顯低于正常對照組(P<0.01，0.05)。見表1。

2.2各組小鼠血清HA、IL-6、SOD、MDA水平比較 模型對照組和杭白菊低、中濃度組的血清HA水平明顯高于正常對照組(P<0.01)，杭白菊高濃度組和水飛薊賓組的血清HA水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，水飛薊賓組和杭白菊低、中、高濃度組的血清HA水平明顯低于模型對照組(P<0.01)，杭白菊低、中濃度組的血清HA水平明顯高于水飛薊賓組(P<0.01，P<0.05)，杭白菊高濃度組與水飛薊賓組的血清HA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，杭白菊中、高濃度組的血清HA水平明顯低于杭白菊低濃度組(P<0.01，P<0.05)，杭白菊中、高濃度組的血清HA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型對照組的血清IL-6水平明顯高于正常對照組和水飛薊賓組(P<0.01，P<0.05)，其余各組的血清IL-6水平組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。除水飛薊賓組和杭白菊低、高濃度組的血清SOD水平明顯高于模型對照組(P<0.01)和杭白菊高濃度組的血清SOD活性明顯高于正常對照組(P<0.05)之外，其余各組的血清SOD活性組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型對照組的血清MDA水平明顯高于其余各組(P<0.01)，水飛薊賓組的血清MDA水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，杭白菊低、中、高濃度組的血清MDA水平明顯高于正常對照組和水飛薊賓組(P<0.01)，杭白菊高濃度組的血清MDA水平明顯低于杭白菊低、中濃度組(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表1 杭白菊提取液對小鼠血清的ALT、AST水平及肝指數(shù)的影響

a:P<0.05,b:P<0.01，與正常對照組比較；c:P<0.05,d:P<0.01，與模型對照組比較；e：P<0.05,f：P<0.01，與水飛薊賓組比較；x：P<0.01，與杭白菊低濃度組比較;y:P<0.01，與杭白菊中濃度組比較

2.3肝組織病理切片檢查 正常對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索排列規(guī)則，中央靜脈管壁光滑，無肝細(xì)胞變性壞死；模型對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞質(zhì)疏松，細(xì)胞核體積變小，肝索排列紊亂甚至消失，中央靜脈管腔內(nèi)堆積大量脫落的壞死肝組織結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞變性壞死區(qū)域明顯由結(jié)締組織代之，以中央靜脈管周邊更為明顯；水飛薊賓組、杭白菊低濃度組和杭白菊中濃度組與模型對照組相比較，前三者的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰，肝細(xì)胞變性壞死數(shù)量和區(qū)域等均有較大的改善，但中央靜脈管腔內(nèi)仍見少量的脫落肝組織結(jié)構(gòu)；杭白菊高濃度組明顯與正常對照組相接近。見圖1。

表2 杭白菊提取液對小鼠血清HA、IL-6、SOD、MDA水平的比較

a:P<0.05,b:P<0.01，與正常對照組比較；c:P<0.05,d:P<0.01，與模型對照組比較；e：P<0.05,f：P<0.01，與水飛薊賓組比較；x：P<0.05,y：P<0.01，與杭白菊低濃度組比較;m:P<0.05，與杭白菊中濃度組比較

A:正常對照組;B:模型對照組;C:水飛薊賓組;D:杭白菊低濃度組;E:杭白菊中濃度組；F:杭白菊高濃度組

圖1 各組小鼠肝組織切片(×400)

3 討 論

CCl4進(jìn)入機體經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肝臟生成自由基CCl3-和CCl3O23-破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使肝細(xì)胞膜磷脂發(fā)生脂質(zhì)過氧化而生成脂質(zhì)過氧化物(LPO)，致使肝細(xì)胞損壞；ALT和AST是胞內(nèi)酶，當(dāng)肝細(xì)胞損壞時會引起血清中的ALT和AST水平升高，血清ALT/AST比值小于1反映肝纖維化，其比值越低則肝纖維化程度越高；SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，它通過清除超氧自由基防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，當(dāng)自由基生成過多或清除能力下降都會引起細(xì)胞損壞；MDA是LPO的中間代謝產(chǎn)物，測定MDA水平可反映LPO水平[11-15]。

肝臟的炎性反應(yīng)和中毒損傷均可引起纖維化；肝纖維化的病理基礎(chǔ)是肝細(xì)胞變性壞死被成纖維細(xì)胞取代，而成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原沉積于肝結(jié)締組織，導(dǎo)致肝纖維化并可演變?yōu)楦斡不?；HA為膠原成分之一，可較準(zhǔn)確靈敏地反映肝內(nèi)已生成的纖維量及肝細(xì)胞受損狀況，HA與肝纖維化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12-13,16]。肝細(xì)胞變性壞死將激活肝臟庫普氏細(xì)胞釋放多種炎癥因子，IL-6是最主要炎癥因子之一，IL-6作用于肝臟成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原進(jìn)一步加重肝細(xì)胞損傷和肝纖維化[17-18]。

本研究結(jié)果顯示：模型對照組的血清ALT/AST比值小于1，HA、IL-6、MDA水平均明顯高于正常對照組，而肝指數(shù)明顯低于正常對照組，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞質(zhì)疏松，細(xì)胞核體積變小，肝索排列紊亂甚至消失，中央靜脈管腔內(nèi)堆積大量脫落的壞死肝組織結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞變性壞死區(qū)域明顯由結(jié)締組織代之；說明本實驗應(yīng)用CCl4成功建立小鼠肝纖維化模型，提示CCl4導(dǎo)致肝纖維化不僅是由于CCl4生成自由基，同時CCl4也引發(fā)肝臟的炎性反應(yīng)，通過這兩方面共同破壞肝細(xì)胞膜使肝臟內(nèi)細(xì)胞變性壞死和膠原沉積所致。

本研究結(jié)果也顯示：水飛薊賓組和杭白菊低、中、高濃度組的血清ALT/AST<1、肝指數(shù)下降，前三者的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較模型正常對照組清晰，肝細(xì)胞壞死數(shù)量和區(qū)域等均有較大的改善，但中央靜脈管腔內(nèi)仍見少量的脫落肝組織結(jié)構(gòu)；杭白菊高濃度組的組織結(jié)構(gòu)明顯與正常對照組相接近；說明這4組小鼠均發(fā)生肝纖維化，4組所用藥物均能不同程度地減輕CCl4對肝細(xì)胞損傷和肝纖維化。此外，本研究結(jié)果還顯示：水飛薊賓組的血清ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA均與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而明顯低于模型對照組，說明水飛薊賓組發(fā)生的肝纖維化程度較小，提示水飛薊賓能有效清除CCl4生成的自由基和改善CCl4引起的炎性反應(yīng)，從而干預(yù)CCl4所致的肝纖維化并起到保護(hù)肝細(xì)胞膜作用。杭白菊低、中、高濃度組的血清ALT、AST和MDA明顯高于正常對照組而明顯低于模型對照組，血清HA明顯低于模型對照組、前兩者明顯高于正常對照組、后者與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；杭白菊低、中、高濃度組血清IL-6既與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，也與模型對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，杭白菊低濃度組的血清SOD明顯高于模型對照組；杭白菊高濃度組的血清SOD明顯高于模型對照組和正常對照組，杭白菊中、高濃度組的血清HA明顯低于杭白菊低濃度組，杭白菊高濃度組的MDA明顯低于杭白菊低、中濃度組；這些說明杭白菊對CCl4所致的肝纖維化有不同程度的改善作用，其既能提高SOD，降低MDA，也能抵制HA生成，雖然血清IL-6與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但也與模型對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，從數(shù)值這一角度說杭白菊也在一定程度上抵制CCl4的炎性反應(yīng)；提示杭白菊可一定程度清除CCl4生成的自由基改善炎性反應(yīng)，在一定程度上顯示有量效關(guān)系。從杭白菊高濃度組的組織切片觀察，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索排列規(guī)則，中央靜脈管壁光滑，無明顯的肝細(xì)胞變性壞死，其組織切片與正常對照組相接近，組織切片結(jié)構(gòu)表現(xiàn)明顯優(yōu)于其血清生化檢測結(jié)果反映；提示杭白菊高濃度組對CCl4造成肝纖維化的改善不僅通過消除自由基和抵制炎性反應(yīng)這兩途徑起作用，很有可能還存在第三條途徑起作用，具體是何途徑有待今后的研究和探討。

綜上所述，CCl4在機體通過生成自由基和引發(fā)炎性反應(yīng)這兩個方面造成肝纖維化；水飛薊賓和杭白菊通過消除機體自由基和炎性反應(yīng)干預(yù)肝纖維化；低濃度和中濃度杭白菊對小鼠肝纖維化模型的各項血清生化指標(biāo)、肝指數(shù)和組織病理切片改善程度劣于水飛薊賓，高濃度杭白菊的各項血清生化指標(biāo)、肝指數(shù)劣于水飛薊賓但組織病理切片優(yōu)于水飛薊賓的改善效果，由此推測杭白菊干預(yù)肝纖維化可能還存在其他途徑。

肝臟是機體的主要解毒器官，它能對機體的有害物質(zhì)及微生物抗原性物質(zhì)進(jìn)行解毒和清除；當(dāng)肝臟發(fā)生纖維化時其解毒功能下降使機體受損[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，杭白菊具有干預(yù)肝纖維化起到保護(hù)肝臟的作用，這為杭白菊在臨床上開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也可為肝纖維化患者帶來福音。