HBV PS1反式激活蛋白2基因對HepG2細胞增殖和凋亡的影響*

鞠蔚華，李 欽，韓 銘，劉順愛，吳 君，成 軍△，梁躍東

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院感染科，貴陽 550004；2.首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所，北京 100015)

原發(fā)性肝細胞癌(HCC)是全球常見的惡性腫瘤之一，尤其以亞洲和非洲國家高發(fā)，也是病死率最高的癌癥之一[1-2]。我國是全球HCC患者最多的地區(qū)，HCC位居常見惡性腫瘤第3位，HCC也在全球癌癥死亡的原因中排名第2位[3]。腫瘤對放化療抵抗及手術切除后復發(fā)與轉移是引起HCC快速發(fā)展和早期侵襲的主要原因[4]，臨床調(diào)查研究表明，原發(fā)性肝癌根治性切除術后病死率可下降至5%以下，但患者術后5年內(nèi)手術部位轉移及復發(fā)率高達60%～70%[5]。因此，尋求HCC發(fā)生、發(fā)展的其他的分子生物學機制，明確誘發(fā)HCC的生物指標并提供有效的診療靶點是當前的迫切任務[6]。研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白(HBV pre-S1)具有廣泛的反式激活功能，通過反式激活，它調(diào)節(jié)肝細胞中相關基因的表達并影響肝細胞分化、增殖、凋亡等生物學功能，在參與HBV致病機制和誘發(fā)肝癌中具有重要作用，但HBV感染導致HCC發(fā)展的分子機制尚未完全清楚[7]。2004年，本課題組運用抑制性消減雜交技術篩選和克隆出HBV P-S1蛋白反式激活靶基因2(PS1TP2)。最近的研究表明，PS1TP2在腫瘤組織如人結腸癌中高表達，但在結腸組織細胞中表達量低甚至不表達，并與腫瘤分化、分級和分期，細胞增殖、遷移和凋亡，放化療等相關[8]。目前鮮見PS1TP2在肝癌中相關作用機制研究的報道。因此，本研究探究PS1TP2對肝癌細胞HepG2增殖與凋亡的影響，以確定PS1TP2是否通過細胞增殖、凋亡影響HBV相關肝病的發(fā)病機制和進展。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞和siRNA L02細胞、HepG2細胞取自北京地壇醫(yī)院傳染病研究所實驗室；PS1TP2 siRNA與目的序列無同源性的通用陰性對照siNC由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。siRNA序列見表1。以上化學合成PS1TP2基因的小片段干擾RNA(siPS1TP2)轉染HepG2細胞，篩選沉默效果最佳干擾序列，用于后續(xù)實驗。

1.1.2試劑 細胞DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清 (美國Life Techology公司)；總RNA提取試劑盒(美國Omega公司)；jet PRIMETM轉染試劑(法國Polyplus Transfection公司)；熒光定量PCR(RT-PCR)試劑Power SYBR GREEN PCR Master Mix(美國Applied Biosystem公司)；細胞凋亡檢測試劑 AnnexinV-FITC和 7-AAD(美國Biolegend公司)；兔抗人腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(m-TOR)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)及Bcl-2相關X蛋白(Bax)、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)-辣根過氧化物酶(HRP)和山羊抗鼠IgG-HRP(美國Santa cruz公司)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR檢測PS1TP2基因在L02、HepG2中的表達 將L02細胞和HepG2細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放于5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)；細胞匯合度為培養(yǎng)瓶底的80%～90%時，即可收集細胞，根據(jù)Total RNA Kit試劑盒步驟提取總RNA，將提取的RNA反轉錄為cDNA,然后依據(jù)Power SYBR?Green PCR Master Mix 說明書檢測PS1TP2基因在兩種細胞中的表達量。

1.2.2PS1TP2 siRNA轉染與分組處理 在HepG2細胞鋪展開在培養(yǎng)瓶底部匯合度為80%～90%時即可分板處理，待6孔板細胞達到60%～70% 匯合度，可分別轉染小干擾RNA(siRNA)作為干擾組、siNC作為對照組進行后續(xù)實驗。

1.2.3CCK-8活性檢測試劑盒測定細胞增殖水平 接種對數(shù)生長期HepG2細胞于3個96孔板(2×103/孔)，各設置6個重復孔。同時轉染后分別于不同時間點(24、48、72 h)加入CCK-8試劑，每孔加10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。上機測定每個孔的450 nm波長的光密度(OD)值，重復3次。

1.2.4Annexin V檢測細胞凋亡程度 轉染培養(yǎng)HepG2細胞48 h后，收集細胞，按照 Annexin V /7-AAD 檢測試劑說明書加入Annexin V與7-AAD染料處理細胞，使用流式細胞儀上機檢測細胞凋亡。

1.2.5RT-PCR檢測目的基因表達水平 轉染后培養(yǎng)HepG2細胞48 h，按照上述實驗方法提取HepG2細胞中總RNA，并把提取的RNA反轉錄為cDNA，然后依據(jù)上述試劑盒的說明書進行相對應基因的表達量檢測，目的基因引物序列見表2。

表1 PS1TP2基因 siRNA序列

表2 目的基因引物序列

1.2.6Western blot檢測AMPK、m-TOR、Bcl-2及Bax的表達水平 小干擾RNA、siNC轉染后48 h蛋白裂解液裂解法提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后進行Western blot,蛋白質樣品進行電泳并保持濕度轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，于1×TBST 配制的5%脫脂牛奶封閉2 h；參照內(nèi)參蛋白標記物切PVDF膜，4 ℃孵育一抗兔抗人AMPK(1∶1 000)、 m-TOR(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶500) 和 GAPDH(1∶1 000)過夜；次日清晨，1×TBST洗膜3次后，加入HRP標記山羊抗兔二抗 (1∶5 000),室溫孵育2 h， 1×TBST洗膜3次，配制好顯色液，于ECL下進行曝光顯影并保存圖像。使用IMAGEPROPLUS軟件進行灰度分析。

2 結 果

2.1PS1TP2在不同肝細胞系中的基礎表達量 RT-PCR結果顯示，PS1TP2基因在L02細胞中mRNA表達水平明顯低于HepG2細胞(P=0.004)，見圖1。

圖1 PS1TP2在兩種肝細胞系中的表達水平比較

圖2 兩組HepG2細胞的增殖曲線比較

2.2兩組HepG2細胞的增殖活性的比較 CCK-8實驗結果顯示，轉染siRNA-PS1TP2的干擾組HepG2細胞的增殖速率明顯慢于轉染siNC的對照組(P=0.02)，見圖2。

A ：兩組HepG2細胞中AnnexinV+細胞數(shù)的變化；B：兩組HepG2細胞中AnnexinV+細胞數(shù)的統(tǒng)計直方圖；：兩組細胞中AnnexinV+細胞數(shù)的比例柱狀圖

圖4 兩組HepG2細胞中AnnexinV+細胞數(shù)比較

2.3兩組HepG2細胞中AMPK、mTOR蛋白的水平比較 Western blot結果顯示，轉染siRNA-PS1TP2干擾組HepG2細胞AMPK的蛋白水平明顯高于轉染 siNC的對照組(P=0.005)，而轉染 siRNA-PS1TP2干擾組HepG2細胞mTOR水平則較轉染siNC的對照組明顯下降(P=0.03)，見圖3。

2.4兩組HepG2細胞中AnnexinV+細胞數(shù)比較 轉染48 h后，流式細胞術檢測結果表明，轉染 siRNA-PS1TP2的干擾組AnnexinV+細胞數(shù)明顯高于轉染siNC的對照組，總凋亡率明顯增加(P=0.02)，見圖4。

2.5RT-PCR 檢測Bcl-2和Bax基因表達水平 RT-PCR檢測結果顯示，轉染siRNA-PS1TP2干擾組HepG2細胞 Bcl-2的mRNA水平明顯低于轉染siNC的對照組(P=0.005)，而轉染siRNA-PS1TP2干擾組HepG2細胞Bax的mRNA水平則較轉染 siNC的對照組明顯升高(P=0.04)，見圖5。

圖5 兩組HepG2細胞Bcl-2和Bax mRNA的表達水平

2.6PS1TP2干擾表達對Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比值的影響 Western blot檢測結果表明，轉染siRNA-PS1TP2干擾組HepG2細胞 Bcl-2蛋白水平明顯低于轉染siNC的對照組(P=0.003)，轉染siRNA-PS1TP2干擾組HepG2細胞Bax蛋白水平則較轉染 siNC的對照組明顯升高(P=0.02)，干擾組Bcl-2/Bax比值較對照組明顯降低(P<0.05)，見圖6。

A：Western blot檢測；B：兩組Bcl-2/Bax比值柱狀圖

圖6 Bcl-2和Bax蛋白水平及PS1TP2對Bcl-2/Bax比值的影響

3 討 論

PS1TP2是2004年本課題組應用基因芯片技術和抑制性消減雜交技術篩選Pre-S1蛋白反式激活靶基因和差異表達基因譜時發(fā)現(xiàn)的長度為573 bp的新型靶基因，并命名為PS1TP2(GenBank號：AY 426673)。在中國，HBV感染是HCC最主要的病因[9]。HBV病毒外膜蛋白包括S蛋白、pre-S1和pre-S2 3種成分，是嗜肝脫氧核糖核酸病毒科中哺乳動物病毒屬一員。其中，pre-S1與DNA損傷，肝細胞氧化應激、變異及肝癌的發(fā)展密切相關[10]。本課題組前期篩選結果表明，PS1TP2可能參與細胞凋亡、細胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生等多種生物學過程，說明PS1TP2可能在HBV相關肝病發(fā)展演變中發(fā)揮促進作用，對其機制的研究，以及對于進一步了解HBV相關肝病的發(fā)病機制具有非常重要的意義。

研究表明,被稱作為“能量感受器”的AMPK在糖調(diào)節(jié)如肝糖原的分解與合成、肌糖原合成和脂類代謝如脂肪酸氧化、蛋白質與膽固醇形成、脂肪形成中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用；在腫瘤細胞及其周圍細胞中AMPK活性降低并伴隨以上生理過程發(fā)生重要改變[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK在細胞的能量代謝及誘導細胞凋亡和周期停滯中發(fā)揮重要作用，影響細胞能量代謝，以適應和支持細胞增殖和生存[13-14]，因而AMPK成為了腫瘤預測和防治的新生物治療靶點之一[15]。而m-TOR是STK進化上保守的一種，匯聚多條信號通路傳遞的信息，為許多通路聚集的交點，并對細胞生長、存活、增殖甚至自噬等過程產(chǎn)生對應的調(diào)控，所以被稱作為細胞活動的“中央調(diào)控器”[16]；m-TOR存在m-TORC1和m-TORC2兩種形式，m-TORC1通過促進或抑制蛋白質合成而影響細胞生長及個體發(fā)育的過程；m-TORC2能感知體內(nèi)因子和能量變化，并參與糖代謝過程，從而干預腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程[17-18]。已有研究證實,AMPK的活化會伴隨著m-TOR信號致癌作用靶點失活，影響肝能量代謝而影響肝癌細胞增殖[19]。在本實驗中，與對照組相比，PS1TP2干擾組中AMPK水平明顯升高，而m-TOR的蛋白水平明顯降低，表明PS1TP2可能是經(jīng)由AMPK-m-TOR途徑活化從而抑制HepG2細胞的增殖。

本研究中AnnexinV/7-AAD結果顯示，PS1TP2的表達下調(diào)加速 HepG2 細胞的凋亡。在細胞凋亡的調(diào)節(jié)中Bcl-2家族發(fā)揮著重要作用，Bcl-2/Bax比值被稱作是啟動細胞凋亡的分子總開關，與腫瘤細胞的存活密切相關。Bax是通過破壞線粒體的滲透性轉換參與線粒體凋亡途徑的代表性凋亡相關蛋白之一，可促進細胞色素C釋放，誘導促進細胞凋亡的發(fā)展。沉默PS1TP2后，應用RT-PCR和Western blot法監(jiān)測干擾組和對照組凋亡相應蛋白Bcl-2和Bax的表達程度，結果表明：通過沉默PS1TP2靶基因后，可下調(diào)凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax比值，改變線粒體凋亡途徑的下游凋亡級聯(lián)效應并加速HepG細胞凋亡。

綜上所述,干擾PS1TP2通過誘導AMPK的活化，伴隨著m-TOR信號致癌作用靶點失活和下調(diào)Bcl-2/Bax比值，從而干擾HepG2細胞的增殖和凋亡過程，參與HBV的致病機制。但PS1TP2通過哪些調(diào)控水平來實現(xiàn)線粒體凋亡的作用，以及其確切的細胞內(nèi)信號傳導機制目前仍不清楚。PS1TP2能否通過其他凋亡途徑影響腫瘤細胞的凋亡，如死亡受體途徑和內(nèi)質網(wǎng)應激途徑，并且這些途徑是否與線粒體凋亡途徑相互作用還需待進一步深入研究。隨著PS1TP2作用機制的進一步研究，PS1TP2或有望能在肝癌預測和治療中發(fā)揮重要作用。