人參皂苷Rh1對人結腸癌細胞侵襲和轉移的影響*

魏 然，肖玉紅，徐維，曾 飛

(南昌大學第二附屬醫(yī)院普外科，南昌 330006)

結直腸癌是一種常見的人類惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計每年有100萬患者受到結直腸癌的影響。在我國，結直腸癌在癌癥相關死因中已躍居第3位，成為男性第三大常見腫瘤和女性第二大常見腫瘤[1]。結直腸癌早期不易診斷，往往直至手術時才發(fā)現(xiàn)多數(shù)腫瘤已經(jīng)穿過漿膜，且多有淋巴結轉移，這為結直腸腺癌的治療增加了難度[2]。影響結直腸癌的侵襲和遷移的原因及影響因素較多[3]。有研究表明，細胞外基質(zhì)(ECM)的被動酶解是結直腸癌侵襲、遷移過程中的重要環(huán)節(jié)。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)是參與破壞細胞外基質(zhì)的一種重要的蛋白水解酶，尤其是MMP-9，其表達產(chǎn)物在癌細胞侵襲、遷移過程中能使基底膜的主要成分Ⅳ型膠原酶解，還可以酶解細胞間基質(zhì)成分[4-7]。MARSHALL等[8]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9的選擇性抑制劑可減慢原位移植結直腸癌模型小鼠腫瘤細胞的生長速度，降低腫瘤轉移率。目前有研究提示，人參皂苷Rh1對人肝癌、惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響，并可以抑制腫瘤的侵襲和遷移[9-10]。而人參皂苷Rh1是通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關蛋白的磷酸化和轉錄，從而激活活化蛋白-1(AP-1)，進而抑制了MMP-9及其他MMP蛋白的表達。同時有研究證明，人參皂苷Rh1抑制MAPK信號通路的方式不完全相同，這種差異可能來自腫瘤細胞本身的影響，但是都可以在轉錄水平抑制AP-1[10-11]。本研究的目的是探究人參皂苷Rh1對人結腸癌細胞SW480侵襲和遷移的影響，初步探索其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 從中國科學院上海生科院細胞資源中心購得人結腸癌細胞株SW480。人參皂苷Rh1濃度為98.76%，購自海永恒生物科技有限公司；佛波酯(PMA)購自Gibcol公司；ELISA檢測試劑盒購自Sigma公司；雙抗購自Cellsignal公司；Transwell BD膠購自Osmonic公司；Western blot及提取蛋白質(zhì)的相關試劑材料購自上海銳賽生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組 將細胞分為對照組，50 ng/mL PMA處理組，30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組，100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組，300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組。

1.2.2細胞劃痕實驗 SW480細胞在普通培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)換液，當細胞濃度達到80%時，用胰蛋白酶消化并計數(shù)。調(diào)整細胞濃度為5×105/mL，按照細胞1×106/孔的密度接種于6孔板中，6孔板底部用黑色標記筆做好標記線，每孔3條平行線，間距0.5 cm左右。按在37 ℃及5%CO2條件下孵育，24 h后細胞面積至少達到90%。第2天，用高壓滅菌100 μL黃槍頭垂直且快速地進行細胞劃痕，與標記線垂直劃出3條線，建立損傷模型。后用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，除去劃下的細胞。板上6個孔分為 6組，每孔分別加入含或不含PMA和人參皂苷Rh1(0、30、100、300 μmol/L)無血清培養(yǎng)基(人參皂苷Rh1預先處理細胞1 h，PMA后處理)，繼續(xù)孵育。此后通過光學顯微鏡每24小時記錄細胞劃痕進程。無菌PBS洗滌2次，光學顯微鏡低倍(×10)觀察并拍照，每孔選取4個劃痕區(qū)視野拍攝劃痕寬度，應用Image-Pro plus6.0軟件進行處理，劃痕寬度=測量空隙的面積/長度。

1.2.3細胞侵襲實驗(Transwell小室法) 使用Boyden室(Millicell Millipore，美國)評估細胞侵襲和遷移。實驗前無血清DMEM培養(yǎng)基(不含雙抗)、Transwell小室、24孔板、槍頭等實驗用品放入-20 ℃冰箱過夜進行預冷，將小量分裝好的Matrigel膠從-20 ℃冰箱移入4 ℃冰箱進行解凍。(1)包被基底膜：冰浴操作，將丙酸倍氯米松(BD)膠用基礎培養(yǎng)基1∶8稀釋。均勻鋪開且不能產(chǎn)生氣泡。每孔50 μL Matrigel注入Transwell小室中,37 ℃孵育Transwell孔板4～5 h。(2)水化基底膜：用1×PBS輕輕潤洗1～2次，去掉未凝的膠。貼壁SW480細胞與各組DMEM完全培養(yǎng)基作用48 h后(人參皂苷Rh1預先處理細胞1 h，PMA后處理),制備SW480細胞懸液，即胰酶消化將細胞分散成單個制備細胞懸液，離心1 000 r/min 5 min，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸1次細胞，除去培養(yǎng)基中的血清，調(diào)整細胞密度至5×105/mL。往已包被好BD凝膠的上室加入200 μL無血清培養(yǎng)基細胞重懸液，下層的培養(yǎng)液中加入500 μL 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含500 μL腫瘤細胞趨化因子)。將接種完畢的24孔板移入 37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。孵育結束后用棉簽擦去上室未穿過的細胞。將小室下端提起，浸潤于95%乙醇中固定10 min。0.1%結晶紫染液染色10 min，清洗掉多余染液，室溫晾干后拍照記錄。計數(shù)每孔中6 個不同視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取平均數(shù)以評估細胞的侵襲能力。每組設3個重復孔。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測MMP-9蛋白水平 取生長良好的對數(shù)期SW480細胞，常規(guī)胰酶消化后進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，每孔150 μL接種于96孔板，每組設3個復孔，孵箱孵育24 h。移液管吸凈培養(yǎng)基，加入各組無血清DMEM培養(yǎng)基，24 h后終止培養(yǎng)，用0.22 μmol/L孔徑的濾過膜過濾培養(yǎng)基上清液，以除去懸浮的死細胞及部分代謝物，離心使上清液濃縮25倍，根據(jù)MMP-9 ELISA試劑盒說明書檢測其中MMP-9的蛋白水平，最小檢出量為7.3 pg/mL。

1.2.5Western blot檢測MMP-9蛋白表達灰度值 細胞處理同ELISA，待SW480生長至90%，消化離心后，再清洗1次后離心，提取沉積物。用中等細胞裂解液和PMSF 100∶1，冰上裂解提取細胞的總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)分析盒確定蛋白水平。蛋白以10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，再將蛋白轉到硝酸纖維素(PVDF)膜上。常規(guī)5%脫脂牛奶封閉，TBST 3次5 min洗膜后，加一抗4 ℃孵育過夜。后繼續(xù)TBST洗膜，加入對應抗兔二抗室溫孵育1 h。二抗孵育結束后，用ECL法顯色，X射線曝光條帶，洗膜。用ImageJ檢測蛋白表達灰度值。

2 結 果

2.1劃痕愈合實驗 30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、300μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組的SW480細胞的遷移距離比分別為50 ng/mL PMA處理組的(0.76±0.03)、(0.60±0.04)、(0.29±0.08)倍(P<0.05)，見圖1。

2.2細胞侵襲實驗 對照組、50 ng/mL PMA處理組、30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組細胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)量分別為261.6±29.7、729.7±36.5、581.7±49.9、359.0±34.4、265.0±34.1。對照組與300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組比較差異無統(tǒng)計意義(P=0.907)，其余組兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

A：對照組劃痕愈合實驗； B：50 ng/mL PMA處理組劃痕愈合實驗； C：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組劃痕愈合實驗； D：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組劃痕愈合實驗；E：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組劃痕愈合實驗；F：各組細胞遷移能力柱狀圖。1：對照組；2：50 ng/mL PMA處理組；3：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組；4：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組；5：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組

圖1 人參皂苷Rh1抑制人結腸癌SW480細胞的遷移能力(×100)

A：對照組細胞侵襲實驗； B：50 ng/mL PMA處理組細胞侵襲實驗； C：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組細胞侵襲實驗； D：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組細胞侵襲實驗；E：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組細胞侵襲實驗；F：各組細胞遷移能力柱狀圖。1：對照組；2：50 ng/mL PMA處理組；3：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組；4：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組；5：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組

圖2 人參皂苷Rh1抑制人結腸癌SW480細胞的侵襲能力(姬姆薩染色，×100)

1：對照組；2：50 ng/mL PMA處理組；3：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組；4：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組；5：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組

圖3 ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中的MMP-9蛋白水平

2.3ELISA檢測MMP-9蛋白水平 對照組、50 ng/mL PMA處理組、30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組細胞培養(yǎng)液中MMP-9蛋白水平分別為(86.67±8.80)、(293.33±31.02)、(196.00±41.51)、(166.33±30.14)、(110.33±26.50) pg/mL。對照組與300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組比較差異無統(tǒng)計意義(P=0.350)。其余組兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4Western blot檢測結腸癌細胞MMP-9的蛋白表達水平 30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組的MMP-9蛋白表達分別為50 ng/mL PMA處理組的(0.80±0.04)、(0.47±0.03)、(0.06±0.00)倍(P<0.05)，見圖4。

圖4 Western blot檢測結腸癌細胞MMP-9的蛋白表達水平

3 討 論

近年來，越來越多的研究團隊開始研究人參皂苷Rh1在腫瘤治療中的作用。孫倩[12]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh1在人宮頸癌Hela細胞系及白血病K56細胞中發(fā)揮了重要的作用，可以抑制B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)的表達及促進Bcl-2相關X蛋白(Bax)的表達增強，進而促進腫瘤細胞的凋亡，同時其作用和藥物濃度有密切的關系。CHOI等[11]證明人參皂苷Rh1可以在人單核白血病細胞中通過抑制細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2，JNK和p38 MAPK的磷酸化進而抑制MAPK信號通路，從而抑制腫瘤的侵襲遷移。YOON等[9]證明人參皂苷Rh1可以抑制AP-1二聚體C-fos和C-Jun的表達，而AP-1被認為在MMP啟動子轉錄激活中起主導作用，因而人參皂苷Rh1可以下調(diào)MMP-1的表達，進而抑制肝癌細胞侵襲轉移。JUNG等[10]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh1可以抑制MAPK和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(P13K/Akt)信號通路和下游的轉錄因子核因子κB(NF-κB)、AP-1的活性及表達，進而下調(diào)MMP-1、MMP-3、MMP-9，從而抑制人惡性膠質(zhì)瘤細胞侵襲轉移。

MMP的表達水平與結腸癌分期及預后密切相關，然而大部分MMP抑制劑因為不良反應大導致作用效果欠佳。因此，研發(fā)新的、不良反應小的MMP選擇性抑制劑用于結腸癌臨床治療具有重要意義。有一些天然藥物表現(xiàn)出MMP抑制特性。芒果苷就是通過PI3K/AKt和MAPK通路，抑制轉錄因子AP-1、NF-κB與MMP-9的結合，從而抑制MMP-9基因的表達[13]。另外青蒿素等也能抑制MMPs的表達，此類天然藥物具有毒副作用少、毒性低的特點[14]。本實驗利用Transwell小室內(nèi)Matrigel膠重建基底膜實驗研究人參皂苷Rh1對SW480細胞侵襲能力的影響。結果表明，PMA能顯著地促進腫瘤細胞侵襲，當Rh1水平為30 μmol/L時發(fā)揮拮抗PMA的作用，并呈濃度依賴性，在人參皂苷Rh1濃度為300 μmol/L時，可以基本上抑制PMA促腫瘤侵襲的作用。細胞侵襲的數(shù)量隨藥物濃度的增加明顯降低，因此說明Rh1能明顯抑制SW480細胞的突破基底膜、胞外基質(zhì)的能力?；啄な悄[瘤細胞侵襲轉移的第一道屏障的重要部分，當腫瘤細胞發(fā)生侵襲時，通過膜表面受體與基底膜成分進行黏附,然后釋放并激活蛋白酶降解基底膜，定向運動穿越基底膜形成的缺損部位。人參皂苷Rh1可抑制SW480細胞突破基底膜的能力，降低發(fā)生遠處轉移的概率。本研究使用細胞劃痕模擬這一環(huán)節(jié)，實驗結果顯示PMA能促進SW480細胞遷移，30 μmol/L Rh1開始拮抗PMA的作用，并呈濃度依賴性，在人參皂苷Rh1濃度為300 μmol/L時，PMA促腫瘤侵襲作用基本上完全被抑制。因此Rh1可以有效降低SW480細胞的運動能力而降低遠處轉移的風險。本實驗采用ELISA、Western blot檢測各組細胞內(nèi)、外MMP-9蛋白表達，結果顯示，50 ng/mL PMA組MMP-9蛋白表達量明顯提高，當人參皂苷Rh1濃度為30 μmol/L時，MMP-9蛋白表達量較50 μmol/L PMA組明顯下降。本研究結果進一步說明了人參皂苷Rh1在結腸癌細胞侵襲和轉移中發(fā)揮了重要作用，作用機制可能是抑制了MMP-9的表達，但其更為詳細的作用機制還不清楚，因此，人參皂苷Rh1在結腸癌細胞侵襲和轉移的作用機制還需進一步研究。