SIRT1 基因在衰老雌鼠卵巢中的表達變化*

王飛清，李艷菊，陶奕汐，楊華，黃璜，王琨，劉洋

（1.貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 檢驗科，貴州 貴陽 550001；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 血液科，貴州 貴陽 550004）

衰老是機體在生命活動過程中一種漸進性的組織、器官退行性改變，其發(fā)生機制復雜，涉及多個衰老基因的異常調(diào)控。目前研究認為，衰老的病理生理學機制主要是隨著年齡增長導致機體損傷的累積所致[1-2]。SIRT1是一種長壽基因，該基因的缺失將導致機體提前衰老，其參與大量與衰老相關的生理病理過程[3]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1具有修復細胞的DNA 損傷、延長壽命、抗氧化等作用，在氧化應激條件下維持細胞存活并達到延長細胞壽命的效果[4-5]。機體中卵巢是較早發(fā)生衰老的器官之一，有研究發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖是卵巢功能減退的的直接因素，在該過程中卵巢細胞凋亡發(fā)揮重要作用[6]。本實驗復制了自然衰老雌鼠模型，通過觀察雌鼠體重、氧化水平、性激素水平的變化，并進一步檢測卵巢SIRT1基因表達情況，解析SIRT1在卵巢功能中的作用。這將為緩解雌性卵巢衰老提出新的思路和方法，為臨床卵巢功能保護和生殖能力改善的藥物開發(fā)提供有實用價值的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 30 只5 周清潔級SD 雌性大鼠由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供，批號為[SCXK（黔）2012-0001]）。

1.1.2 主要儀器和試劑 T5000Y 型電子天平（美國雙杰兄弟有限公司常熟雙杰測試儀器廠），F(xiàn)A1204B分析天平（上海精科天美科學儀器有限公司），Olympus 雙目光學顯微鏡（奧林巴斯光學工業(yè)株式會社），TGL-16M 高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），-80℃冰箱（日本Sanyo 公司）。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、總抗氧化能力（total-anti-oxidation capacity,T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所），SIRT1 抗體（武漢博士德生物工程有限公司），促黃體激素（luteotropic hormone,LH）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）、雌二醇（Estradiol,E2）試劑盒（上海聯(lián)科生物技術有限公司），實時熒光定量聚合酶鏈反 應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）（北京全式金生物技術有限公司），Trizol試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。引物序列由Primer 3 設計，上海英俊公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物處理 雌鼠自由飲用自來水和飼料，根據(jù)醫(yī)用實驗動物學顯示[7]，大鼠在4 周相當于3 ～5 歲，12 周相當于10 ～12 歲，24 周相當于18 ～20 歲，48 周 相當于35 ～40 歲，72 周相當于50 ～55 歲，72 周確定為大鼠老年期。因此本實驗將雌鼠分為6、12、24、48 及72 周飼養(yǎng)，于不同時間段用10%水合氯醛麻醉，股動脈取血處死6 只雌鼠。取出卵巢剔除臟器周圍脂肪和結締組織，濾紙吸干表面血液，將一側卵巢迅速分裝至-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?，另一側卵巢用多聚甲醛溶液固定?/p>

1.2.2 體重測量 每3天早上（8：00 ～10：00）用電子天平對雌鼠進行稱重并記錄。

1.2.3 氧化水平檢測 股動脈取血，3 500 r/min 離心10 min 分裝血清低溫保存?zhèn)溆?。采用二硫代二硝基苯甲酸法檢測GSH-Px 活性；采用Fe3+還原法檢測T-AOC，嚴格按照試劑盒說明書步驟完成實驗。

1.2.4 性激素檢測 股動脈取血，用黃色分離膠促凝管收集血液8 ～10ml，3500r/min 離心10min，分離血清于Epp 管中分裝，放于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｑ宸?7℃電熱恒溫水浴鍋中解凍，采用ELISA 法檢測血清中的LH、FSH、E2水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟完成實驗。

1.2.5 qRT-PCR 檢測卵巢組織中SIRT1 mRNA 表達 取1 g 卵巢組織加入Trizol 試劑，根據(jù)試劑盒說明書操作提取卵巢組織總RNA，進行基因片段擴增并定量。cDNA 反應體系：總RNA 樣品為2.5 μl，Random primer 1 μl，2×ES Reaction Mix 10 μl，Enzyme Mix 1 μl，gDNA Remover 1 μl，加無酶水至總體積20 μl。PCR 反應體系：各PCR 反應管中所加模板RNA 的量約為1.8 μl，正反向引物各0.5 μl，Green qPCR Super Mix 10 μl，加無酶水至總體積20 μl。反應條件：94℃預變性30 s，94℃變性5 s，45℃退火15 s，72℃ 延伸10 s，共45 個循環(huán)。SIRT1PCR 擴增結果通過PCR 儀記錄的Ct 值對起始模板相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 免疫組織化學法檢測卵巢組織SIRT1 蛋白 處死雌鼠后，迅速取其一側卵巢，立即放入10%中性甲醛固定液中固定，待固定液浸透后，用鋒利的刀片取大小1 mm×1 mm×1 mm 左右的卵巢組織，石蠟包埋，常規(guī)切片，免疫組織化學法檢測卵巢組織SIRT1 蛋白表達情況。SIRT1 蛋白定位于細胞漿中，陽性細胞胞漿著色呈棕黃色，不顯棕黃色者為陰性細胞。在高倍鏡下，每張切片隨機取5 個視野，計算每個視野下100 個細胞中陽性細胞百分比（陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）。

1.2.7 觀察卵巢組織病理形態(tài) 處死雌鼠后，迅速取下一側卵巢，經(jīng)多聚甲醛溶液固定3d 后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色。光學顯微鏡下觀察卵巢組織結構有無形態(tài)學改變。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，多組比較采用單因素方差分析，進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同時間點雌鼠體重變化

雌鼠體重6、12、24、48 及72 周分別為（178.167± 11.957）、（236.833±14.580）、（303.667±13.171）、（334.850±10.504）及（346.500±5.541）g，隨著時間的延長，雌鼠體重逐漸增加（F=223.470，P=0.000），除48 與72 周比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其他時間點兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各時間點大鼠體重變化趨勢 （n =6，±s）

2.2 不同時間點雌鼠氧化水平變化

雌 鼠 血 清GSH-Px 在6、12、24、48 及72 周表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=19.471，P=0.000），6、12 及24 周比較，雌鼠血清GSH-Px 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），48和72周雌鼠血清GSH-Px較6、12 及24 周下降，72 周雌鼠血清GSH-Px 與48 周比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

雌鼠血清T-AOC 在6、12、24、48 及72 周表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.518，P=0.001），6、12 及24 周比較，雌鼠血清T-AOC 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），48 和72 周雌鼠血清T-AOC 下降較6、12及24 周（P＜0.05），且12 與48 周比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），72 周雌鼠血清T-AOC 與6、12 及24 周比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 不同時間點雌鼠性激素變化

雌鼠血清FSH 和LH 在6、12、24、48 及72 周表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=73.421 和28.503，均P=0.000），6、12 及24 周比較，雌鼠血清FSH 和LH 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），48 和72 周較6、12及24 周升高（P＜0.05），且48 與72 周比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 不同時間段雌鼠血清GSH-Px 和T-AOC 比較 （n =6，u/ml，±s）

表2 不同時間段雌鼠血清GSH-Px 和T-AOC 比較 （n =6，u/ml，±s）

注：1）與48 周比較，P＜0.05；2）與6、12 及24 周比較，P＜0.05

時間 GSH-Px T-AOC 6 周 1 147.817±127.535 19.583±1.876 12 周 1 106.050±112.249 20.500±2.1271）24 周 1 180.017±109.772 19.367±2.351 48 周 922.983±100.1872） 17.533±1.226 72 周 714.150±87.4601）2） 15.783±1.1392）

雌鼠血清E2在6、12、24、48 及72 周表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=22.579，P=0.000），6、12 及24 周雌鼠血清E2逐漸升高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），48 和72 周雌鼠血清E2逐漸降低，48 周與12 和24 周比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），72 周與各組比較，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 不同時間點雌鼠卵巢SIRT1 mRNA 和蛋白水平變化

雌鼠 卵 巢SIRT1 mRNA 在6、12、24、48 及72周表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=56.271，P= 0.000），雌鼠卵巢SIRT1mRNA 逐漸降低，24 與6 周比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），48 和72 周與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

雌鼠卵巢SIRT1 蛋白在6、12、24、48 及72 周表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.556，P= 0.001），48 周與6 和12 周比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），72 周與6、12 和24 周比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表4）。免疫組織化學結果見圖2。

表3 不同時間點雌鼠血清性激素水平比較 （n =6，±s）

表3 不同時間點雌鼠血清性激素水平比較 （n =6，±s）

注：1）與48 周比較，P ＜0.05；2）與6、12 及24 周比較，P ＜0.05

時間 FSH/（IU/L） LH/（u/ml） E2/（ng/L）6 周 10.367±1.447 2.917±0.376 135.371±18.284 12 周 10.200±0.815 3.067±0.339 141.765±13.4231）24 周 10.283±1.375 2.633±0.301 144.473±15.351）48 周 14.933±1.1222） 3.667±0.5392） 120.069±17.885 72 周 21.433±1.9761）2） 5.217±0.6941）2） 69.374±14.4311）2）

表4 不同時間點雌鼠SIRT1 mRNA 和蛋白水平比較 （n =6，±s）

表4 不同時間點雌鼠SIRT1 mRNA 和蛋白水平比較 （n =6，±s）

注：1）與6 周比較，P ＜0.05；2）與12 周比較，P ＜0.05； 3）與24 周比較，P ＜0.05

時間 SIRT1 mRNA SIRT1 蛋白6 周 0.973±0.058 49.167±8.110 12 周 0.952±0.030 51.333±7.789 24 周 0.913±0.0671） 44.833±4.977 48 周 0.767±0.0961）2）3） 39.333±5.3911）2）72 周 0.614±0.0471）2）3） 34.833±5.7761）2）3）

圖2 不同時間點雌鼠卵巢SIRT1 表達水平 （HE×200）

2.5 不同時間點雌鼠卵巢組織病理變化

各時間點雌鼠卵巢外觀未見萎縮、水腫等病變，卵巢組織色澤正常質(zhì)軟。光學顯微鏡下6、12 及24 周卵巢組織結構形態(tài)未見明顯病變，可見各級卵泡，卵泡顆粒細胞形態(tài)規(guī)則，可見清晰卵丘等結構。隨著時間延長，48 周雌鼠卵巢組織與6、12 及24 周比較，閉鎖卵泡增多，黃體和各級發(fā)育卵泡減少，組織間隙可見少量脂滴。72 周雌鼠卵巢組織閉鎖卵泡明顯增多，黃體和各級發(fā)育卵泡明顯減少，卵泡顆粒細胞減少，排列松散，組織間隙可見大量脂滴，呈現(xiàn)明顯衰老的特征。見圖3。

圖3 不同時間點雌鼠卵巢組織病理變化 （HE×200）

3 討論

衰老是生命運動中不可避免的過程，只是不同個體在不同時期衰老的進程并不相同，環(huán)境污染、生活工作壓力增加以及生育政策等加速女性的衰老。研究表明，體重增加導致肥胖可影響包括心血管疾病、糖尿病、癌癥、代謝紊亂以及生殖功能衰退的風險[8-9]。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨著機體衰老，體重增加對女性生殖功能有著不利的影響[10]。根據(jù)動物學實試驗顯示，48周雌鼠進入衰老進程，且72 周確定為大鼠老年期。本實驗結果顯示，隨著飼養(yǎng)時間的延長，雌鼠體重逐漸增加，且48 和72 周雌鼠體重高于其他各組?？v觀近一個世紀的衰老研究歷程，產(chǎn)生許多有關衰老分子機制的學說，其中，包括經(jīng)典的氧自由基學說等[11-12]。本實驗結果顯示，隨著飼養(yǎng)時間的延長，雌鼠血清GSH-Px和T-AOC 水平降低，可推斷在機體衰老過程中，機體內(nèi)環(huán)境發(fā)生了明顯變化。

卵巢衰老是自然的生理過程，主要原因在于卵泡的不斷消耗引起卵巢儲備功能的下降。其機制是卵巢內(nèi)微環(huán)境的改變，導致卵泡質(zhì)量下降，進一步出現(xiàn)卵巢分泌E2水平下降等一系列表現(xiàn)[13]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，雌激素是女性青春魅力的源泉，其含量能促進女性卵泡發(fā)育、成熟、排卵，乳腺等女性生殖器官的生長和發(fā)育[14-15]。本實驗結果顯示，隨著時間的延長，雌鼠血清E2逐漸降低，此時性腺軸垂體負反饋調(diào)節(jié)FSH 和LH 水平升高。同時本實驗卵巢病理結果進一步顯示，雌鼠卵巢組織隨著時間延長閉鎖卵泡明顯增多，黃體和各級發(fā)育卵泡水平減少，卵泡顆粒細胞減少，排列松散，組織間隙可見大量脂滴，呈現(xiàn)明顯衰老的特征。

衰老是生物機體必然發(fā)生的復雜生命現(xiàn)象，整體表現(xiàn)為代謝能力下降、適應能力減退等。近年來抗衰老 基因SIRT1已成為國內(nèi)外學者研究的熱點，SIRT1是調(diào)節(jié)生物體衰老進程的一個重要基因，在調(diào)節(jié)基因表達、細胞凋亡、代謝和老化過程中發(fā)揮積極作用[16-17]。SIRT1的特殊結構決定它的生物學功能，包括參與基因轉錄、DNA 復制、損傷修復和代謝調(diào)控等一系列的細胞活動，其依賴NAD+的組蛋白去乙?；窼IRT1在調(diào)節(jié)細胞的代謝、分化與衰老等方面都有著關鍵的影響與作用。SIRT1還與年齡有關的活性氧之間有極重要的關系，兩者都依賴于線粒體的代謝來維持其高濃度而發(fā)揮作用。國外研究報道，SIRT1基因缺陷小鼠不能生育，同時表現(xiàn)出卵泡發(fā)育成熟受抑制以及性成熟推遲[18-19]。本實驗結果顯示，隨著時間延長雌鼠卵巢SIRT1基因和蛋白水平降低，同時性激素分泌明顯異常，卵巢呈現(xiàn)明顯衰老特征，表明SIRT1在調(diào)控哺乳動物生殖系統(tǒng)的生物學功能方面有著不可或缺的作用。

本實驗成功復制自然衰老雌鼠模型，表現(xiàn)在衰老雌鼠體重明顯增加，抗氧化水平降低加速機體的衰老，卵巢呈現(xiàn)明顯衰老癥狀誘發(fā)性激素的異常，且抗衰老基因SIRT1在衰老雌鼠卵巢表達降低，推斷SIRT1基因在衰老大鼠卵巢生殖功能異常中發(fā)揮重要作用。未來臨床利用相關技術激活SIRT1基因活化是否成為延緩卵巢早衰靶點有待進一步研究。