光動(dòng)力新藥帕利泊芬研究進(jìn)展

閔祥燕，曹寧，嚴(yán)懿嘉，陳志龍*

（1. 東華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院，上海 201620；2. 上海先輝醫(yī)藥科技有限公司，上海 200433）

光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT） 是一種微創(chuàng)、治療淺表性腫瘤的新方法，是將光敏劑（photosensitizer，PS）定位于靶組織上，PS吸收特定波長(zhǎng)的光后，發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而殺傷和消滅目標(biāo)位置上的腫瘤細(xì)胞。帕利泊芬（1，padelipor fin，WST11，Tookad?Soluble，Stakel?）是一種與鈀配位的細(xì)菌葉綠素衍生物，分子式：C37H41N5O9PdS（CAS：698393-30-5），由 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center、Steba Biotech 和 Weizmann Institute of Science 這 3 家公司聯(lián)合研制，已于2017年11月獲歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)上市，作為進(jìn)行血管靶向PDT（vasculartargeted PDT，VTP）的PS，用于治療前列腺癌；其用于治療腎癌的研究處于Ⅱ期臨床階段。本品具有水溶性，靜脈給藥后，可靶向聚集于腫瘤組織，被適當(dāng)波長(zhǎng)的光激活并產(chǎn)生大量活性氧（ROS），進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。本文主要對(duì)帕利泊芬的作用機(jī)制、合成路線、藥理作用以及臨床研究進(jìn)行介紹。

1 帕利泊芬作用機(jī)制

PS是一類在光照射下能產(chǎn)生ROS的化合物，理想的PS應(yīng)具有水溶性。此外，其激發(fā)波長(zhǎng)應(yīng)在PDT光學(xué)“窗口”（650～850nm）內(nèi)，能最大化地穿透組織[1-3]。光動(dòng)力療法主要有2種作用機(jī)制：激發(fā)態(tài)PS（S1）通過(guò)系間竄越將能量轉(zhuǎn)移到激發(fā)三重態(tài)（T1），并通過(guò)電子或質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程直接與基質(zhì)或溶劑反應(yīng)，產(chǎn)生自由基和超氧陰離子，超氧陰離子可進(jìn)一步反應(yīng)生成過(guò)氧化氫（Ⅰ型反應(yīng)）；此外激發(fā)三重態(tài)PS也可以產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O2），1O2可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死直接殺死腫瘤細(xì)胞（Ⅱ型反應(yīng)）[4-6]。若超氧陰離子濃度過(guò)高，過(guò)氧化氫會(huì)與超氧陰離子反應(yīng)，生成具有更高活性的羥基自由基，而羥基自由基在細(xì)胞內(nèi)可以進(jìn)攻和氧化任意的生物分子。此外也可能是由超氧陰離子與周圍的鐵離子或銅離子之間發(fā)生芬頓反應(yīng)（Fenton’s reaction），產(chǎn)生羥基自由基[6-10]。帕利泊芬作為一種高效的PS，在水溶液中經(jīng)歷Ⅰ型反應(yīng)機(jī)制[11]，產(chǎn)生了帶電或中性自由基，這些自由基迅速與氧分子反應(yīng)生成ROS，從而殺死腫瘤細(xì)胞。光敏劑作用機(jī)制如圖1所示。

圖1 光敏劑作用機(jī)制Figure 1 Mechanism of photosensitizer

2 帕利泊芬的發(fā)現(xiàn)歷程及其合成路線

在帕利泊芬問(wèn)世之前，已有數(shù)個(gè)卟啉類藥物被用于腫瘤的臨床治療。血卟啉衍生物Photo fin是全球首個(gè)獲批準(zhǔn)上市的光敏劑，隨后與Photo fin結(jié)構(gòu)相近的卟啉衍生物喜泊芬及Photogem等也先后在俄羅斯、德國(guó)和中國(guó)上市。然而，這類光敏劑存在一些缺點(diǎn)：首先，其吸收波長(zhǎng)為410nm，接近太陽(yáng)光的輻射波長(zhǎng)（475nm），且光敏劑在體內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng)，PDT治療后患者會(huì)出現(xiàn)明顯皮膚光毒性，病人需在治療后避光28～42d；其次，治療使用的可見(jiàn)光的組織穿透強(qiáng)度較弱，治療深度淺；另外，此類PS摩爾吸光系數(shù)小，因此往往需要提高藥物劑量或光劑量來(lái)達(dá)到治療效果，毒副作用大。

近年來(lái)，研究人員將注意力轉(zhuǎn)向了葉綠素和細(xì)菌葉綠素的衍生物，其具有特定的吸收光譜區(qū)域（650～850nm）和激活后能快速降解的特性，被認(rèn)為是兩類更具優(yōu)勢(shì)的PS。與葉綠素類衍生物相比，細(xì)菌葉綠素衍生物是一類具有2個(gè)不飽和吡咯環(huán)的四吡咯大環(huán)，其通常在近紅外（NIR）范圍內(nèi)的750nm處的PDT光學(xué)窗口內(nèi)具有Qy吸收帶，在近紅外光區(qū)組織滲透至8mm[12]。不過(guò)，細(xì)菌葉綠素衍生物在常溫常壓下不穩(wěn)定，且與血卟啉衍生物相比，其單線態(tài)氧的產(chǎn)量較低（由中心金屬離子決定）[13]。為了增加細(xì)菌葉綠素衍生物在常溫常壓下的穩(wěn)定性，Avigdor等[13]嘗試將其中心原子Mg替換為2價(jià)的Pd、Pt、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn等。該課題組發(fā)現(xiàn)，中心原子Mg被Pd取代后，可顯著增加細(xì)菌葉綠素大環(huán)的氧化電位，同時(shí)可以大大提高分子的跨系統(tǒng)速率，使其達(dá)到激發(fā)三重態(tài)。Pd-細(xì)菌葉綠素衍生物的生物分布和藥動(dòng)學(xué)研究顯示，其僅保留在血液循環(huán)中且在光照后的保留時(shí)間很短，解決了病人在PDT后需長(zhǎng)期避光的問(wèn)題。然而，Pd-細(xì)菌葉綠素衍生物在水溶液中溶解度低，配制注射藥物時(shí)，需要使用增溶劑（如氫化蓖麻油）來(lái)增加其溶解性，使用大劑量的增溶劑曾在小鼠實(shí)驗(yàn)中引發(fā)了諸多不良反應(yīng)（如呼吸急促、萎靡不振等）。因此，增加Pd-細(xì)菌葉綠素衍生物的水溶性是迫切需要解決的另一個(gè)問(wèn)題。

此前，有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌葉綠素a（2）的17位碳原子位置被氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)等多種分子取代后，可增加化合物的親水性[14]。Rosenbach-Belkin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌葉綠素的絲氨酸衍生物水溶性顯著改善，且在小鼠實(shí)驗(yàn)中顯示出較快的血液循環(huán)清除速率。遺憾的是，絲氨酸-細(xì)菌葉綠素衍生物極不穩(wěn)定，能被光迅速氧化。但這也為Avigdor等研究如何提高Pd-細(xì)菌葉綠素衍生物溶解度提供了有意義的參考，即在Pd-細(xì)菌葉綠素衍生物17位碳原子位置引入親水基團(tuán)，如COO-、COS-、SO3-和 PO32-等[12]。在 Pd-細(xì)菌葉綠素衍生物的17位碳原子位置引入SO3-，即制得帕利泊芬，其可直接溶于水。此外，生物分布和藥動(dòng)學(xué)分析研究亦獲得了令人滿意的結(jié)果。在荷有M2R黑素瘤和HT-29結(jié)腸癌的模型小鼠中進(jìn)行的研究證實(shí)帕利泊芬具有顯著抗腫瘤作用，另外，該藥物在動(dòng)物體內(nèi)的清除速率快，是非常理想的血管靶向PS。

圖2介紹了帕利泊芬及其前體藥物padopor fin（3，WST09）的合成路線。值得一提的是，padopor fin也曾進(jìn)入前列腺癌治療的臨床階段，但研究結(jié)果顯示其會(huì)引發(fā)低血壓等副作用，且副作用較大[16-21]。根據(jù)文獻(xiàn)方法，首先從球形細(xì)菌的培養(yǎng)物中提取得到原料細(xì)菌葉綠素a，通過(guò)稀鹽酸脫去配位金屬M(fèi)g，得到化合物4。隨后將醋酸鈀加入到化合物4的二氯甲烷/甲醇混合溶液中，在氬氣保護(hù)下室溫過(guò)夜攪拌，鰲合形成padopor fin[22]。最后，將padopor fin完全溶解于DMSO中，并加入催化當(dāng)量的1，3-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP），最后添加適量溶解?；撬岬腒2SO3溶液（pH=8.2），在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下室溫避光攪拌4d，最終得到13-C位置開(kāi)環(huán)的產(chǎn)物，即帕利泊芬[13,23]。

圖2 帕利泊芬的合成線路Figure 2 Synthetic route of padeliporfin

3 帕利泊芬的藥理學(xué)研究

3.1 體外研究

3.1.1 細(xì)胞對(duì)帕利泊芬的攝取與細(xì)菌葉綠素衍生物的性質(zhì)類似，帕利泊芬呈現(xiàn)出非常弱的熒光，因此不能通過(guò)熒光法來(lái)對(duì)細(xì)胞攝取帕利泊芬進(jìn)行定量檢測(cè)[24]。每個(gè)帕利泊芬分子結(jié)構(gòu)中都含有一個(gè)Pd原子，且生理?xiàng)l件下吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)螯合的Pd離子非常穩(wěn)定，因此，可以通過(guò)測(cè)定細(xì)胞中的Pd原子含量，來(lái)表征細(xì)胞對(duì)帕利泊芬的攝取量[24]。

Posen等[25]將小鼠黑素瘤單層細(xì)胞分別與濃度為0、15、30、60 和 100nmol·L-1的帕利泊芬溶液一起孵育 4h，然后用功率為20mW的激光器照射10min。光照后立即用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Pd原子的含量，從而確定細(xì)胞內(nèi)帕利泊芬的含量。結(jié)果顯示，隨著帕利泊芬濃度的遞增，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)Pd原子的含量也遞增。光照后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)，測(cè)定細(xì)胞的存活率。結(jié)果表明，隨著帕利泊芬濃度的遞增，細(xì)胞攝取到的帕利泊芬也增多，胞內(nèi)帕利泊芬在光照下被激活后，細(xì)胞存活率隨溶液中帕利泊芬濃度遞增而降低（見(jiàn)圖3）。

圖3 黑素瘤細(xì)胞在不同濃度帕利泊芬溶液中的Pd攝取量及光照后存活率Figure 3 The Pd uptake and survival rate of melanoma cells at different concentrations of padeliporfin

Brandis等[23]研究了溫度和血清等因素對(duì)細(xì)胞攝取帕利泊芬的影響，發(fā)現(xiàn)在37℃時(shí)，細(xì)胞中帕利泊芬濃度在最初 5～10min 內(nèi)迅速增加，于培養(yǎng)開(kāi)始后的 50～60min趨于穩(wěn)定；而溫度降至4℃時(shí)，帕利泊芬能夠迅速滲透入細(xì)胞并在培養(yǎng)10min后胞內(nèi)濃度達(dá)到平穩(wěn)；在沒(méi)有血清的情況下帕利泊芬能形成直徑為1～2nm的小聚集體，但小聚集體并不影響細(xì)胞膜的吸附[26]。黑色素瘤細(xì)胞攝取帕利泊芬的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，帕利泊芬在細(xì)胞中的攝取是由血清白蛋白運(yùn)輸介導(dǎo)的。Mazor等[24]也證明了帕利泊芬與血清白蛋白絡(luò)合會(huì)促進(jìn)細(xì)胞攝取帕利泊芬。

3.1.2 帕利泊芬的細(xì)胞毒性研究在細(xì)胞PDT實(shí)驗(yàn)中，隨著帕利泊芬濃度的增加，細(xì)胞存活率遞減。為了確定是單純的高濃度藥物殺死了細(xì)胞，還是藥物發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)后殺死細(xì)胞，Posen等[25]將小鼠胚胎心臟內(nèi)皮細(xì)胞（H5V）分別與不同濃度（0、10、100和1000nmol·L-1）的帕利泊芬一起孵育 4h 后，分別用功率為20mW的激光器照射10min以及避光處理，然后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測(cè)，測(cè)定細(xì)胞的存活率。研究顯示，光照處理的細(xì)胞，隨著培養(yǎng)物中帕利泊芬濃度的增加，細(xì)胞存活率下降，半數(shù)致死劑量（LD50）約為 30nmol·L-1；相反，對(duì)于避光處理的細(xì)胞，帕利泊芬濃度對(duì)細(xì)胞存活率影響不明顯（見(jiàn)圖4）。因此細(xì)胞攝取到的帕利泊芬，只有在被光激活后才會(huì)殺死細(xì)胞且細(xì)胞存活率隨帕利泊芬濃度遞增而降低。即帕利泊芬對(duì)細(xì)胞的光毒性明顯，而暗毒性很小。

圖4 帕利泊芬在光照和避光條件下的細(xì)胞毒性Figure 4 Cytotoxicity of padeliporfin under light and dark conditions

3.2 動(dòng)物體內(nèi)研究

利用腫瘤動(dòng)物模型進(jìn)行PDT實(shí)驗(yàn)是篩選抗腫瘤PS的常用手段之一。Mazor等[24]將黑素瘤模型小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，給實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射帕利泊芬（6mg·kg-1），然后用 45J·cm-2的激光照射，經(jīng)皮照射腫瘤部位5min；對(duì)照組小鼠接受給藥不照光、照光不給藥或不給藥亦不照光的處理方式。結(jié)果顯示，接受不同處理的對(duì)照組小鼠，其腫瘤生長(zhǎng)速率相似，且尾靜脈注射30min后未觀察到小鼠出現(xiàn)皮膚光毒性。在PDT實(shí)驗(yàn)后，所有實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)治療的腫瘤部位在24～48h內(nèi)均發(fā)生腫瘤組織的壞死，小鼠繼續(xù)養(yǎng)殖14d后原腫瘤部位均變平，到90d后約有60%的小鼠被治愈。

此外Fleshker等[27]也開(kāi)展了類似研究，對(duì)荷有CT26 結(jié)腸癌的小鼠尾靜脈注射帕利泊芬（6mg·kg-1），然后進(jìn)行PDT治療。治療后，向小鼠體內(nèi)注射可識(shí)別腫瘤的熒光素，再用生物熒光成像（bioluminescence imaging，BLI）監(jiān)測(cè)每只小鼠的腫瘤變化情況，若BLI信號(hào)為陰性則說(shuō)明小鼠體內(nèi)沒(méi)有腫瘤，若BLI信號(hào)為陽(yáng)性則說(shuō)明小鼠體內(nèi)有腫瘤。實(shí)驗(yàn)中共有53只小鼠接受PDT，其中有40例BLI信號(hào)為陰性，有39例在隨后的90d觀察期間未觀察到BLI陽(yáng)性信號(hào)，僅有1例在PDT后第30d死亡（未見(jiàn)腫瘤再生），即PDT后約75%（40/53）的小鼠腫瘤治愈，其余13只小鼠PDT24h后，觀察到BLI陽(yáng)性信號(hào)，且在隨后的觀察期間可見(jiàn)局部腫瘤復(fù)發(fā)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，帕利泊芬治療結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠的療效顯著。

4 帕利泊芬治療前列腺癌的臨床應(yīng)用

帕利泊芬作為治療前列腺癌的新型血管靶向PS，已成為PDT研究領(lǐng)域近年來(lái)的熱點(diǎn)。臨床上，全身麻醉的前列腺癌患者接受靜脈注射帕利泊芬（4mg·kg-1），同時(shí)，經(jīng)直腸和會(huì)陰將裝有超聲光纜的中空塑料針置于患者前列腺內(nèi)，用光纖功率為150mW的激光照射，其輸送的纖維數(shù)量和總光能隨腫瘤位置和前列腺體積而變化[28]，可用于局部前列腺癌的治療。

Lebdai等[26]對(duì)82名前列腺癌患者靜脈注射帕利泊芬（4mg·kg-1）后進(jìn)行 PDT 治療，治療 6 個(gè)月后對(duì)所有患者進(jìn)行前列腺活檢。結(jié)果顯示，有62名（76%）患者活檢結(jié)果為陰性，20名患者活檢結(jié)果為陽(yáng)性，其中，有9名（11%）患者為臨床顯著癌（clinically signi ficant cancer），另外的11名（13%）患者為臨床非顯著癌（non-clinically signi ficant cancer）。此外，Azzouzi等[29]也開(kāi)展了類似的臨床研究，對(duì)114名前列腺癌患者進(jìn)行PDT，治療6個(gè)月后對(duì)所有患者進(jìn)行前列腺活檢，其中有78名（68.4%）患者的活檢結(jié)果為陰性。上述臨床研究結(jié)果均證實(shí)帕利泊芬治療前列腺癌療效顯著。

5 帕利泊芬治療前列腺癌的優(yōu)勢(shì)

5.1 水溶性好，靶向性高

帕利泊芬是一種水溶性的血管靶向PS，通過(guò)血液循環(huán)可直接靶向聚集于前列腺癌細(xì)胞，并在癌細(xì)胞內(nèi)被激活，從而產(chǎn)生大量的ROS，發(fā)揮其治療前列腺癌的功能[30]。

5.2 代謝快，體內(nèi)無(wú)蓄積

Brandis等[23]研究了帕利泊芬在小鼠和大鼠中的藥動(dòng)學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)帕利泊芬僅保留在血液循環(huán)中，且血液中的保留時(shí)間非常短。Mazor等[24]對(duì)小鼠尾靜脈注射帕利泊芬（6mg·kg-1），并在此后的不同時(shí)間點(diǎn)，分別測(cè)定小鼠心、肝、脾、肺、腎以及血液中的藥物濃度。結(jié)果顯示，尾靜脈注射2min后，血液中帕利泊芬的含量最高，在注射后5min僅在肝、脾、肺、腎和血液中發(fā)現(xiàn)存有帕利泊芬。給藥24h后，所有組織中均檢測(cè)不到帕利泊芬。帕利泊芬能在組織中快速清除可能與引入的牛磺酸基團(tuán)有關(guān)[31]。牛磺酸是細(xì)胞液中的β-氨基酸，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的肝臟中，參與肝臟的解毒。在解毒過(guò)程中，?；撬崤c肝臟中不同分子結(jié)合可增加藥物的水溶性，從而促進(jìn)了肝臟對(duì)藥物的清除[32]。圖7顯示了帕利泊芬在小鼠體內(nèi)的生物分布情況。研究人員發(fā)現(xiàn)帕利泊芬可以從血液中快速消除，不會(huì)在皮膚組織中積聚，從而確保帕利泊芬具有較低的皮膚光毒性[33]。

5.3 安全性高

Lebdai等[26]使用IPSS和IIEF-5問(wèn)卷分別評(píng)估了前列腺癌患者在PDT治療后的泌尿系統(tǒng)癥狀和勃起功能。40名前列腺癌患者經(jīng)PDT治療后，其中有38名患者在治療后第1d無(wú)需導(dǎo)尿管，另外2名患者在PDT治療幾天后也無(wú)需導(dǎo)尿管。臨床研究結(jié)果證明帕利泊芬不會(huì)引起患者的心血管毒性或肝酶改變、術(shù)中麻醉問(wèn)題、直腸瘺或皮膚光敏等，IPSS評(píng)分和IIEF-5評(píng)分也未受較大影響。綜合評(píng)價(jià)認(rèn)為，帕利泊芬在臨床使用方面具有良好的安全性。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

隨著新型PS的不斷開(kāi)發(fā)，PDT在臨床中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。帕利泊芬作為一種水溶性的血管靶向PS，可直接靶向聚集于腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)被激活，發(fā)生一系列的光化學(xué)反應(yīng)從而發(fā)揮抗腫瘤療效。目前研究認(rèn)為，帕利泊芬治療前列腺癌有較好療效，但患者經(jīng)PDT后會(huì)產(chǎn)生血尿、會(huì)陰疼痛和射精失敗等副作用，還需要其他輔助療法來(lái)消除這些副作用。因此帕利泊芬治療前列腺癌引起的不良反應(yīng)還需要進(jìn)一步的深入研究，這將有助于帕利泊芬的合理應(yīng)用，對(duì)其能夠安全有效地用于治療前列腺癌具有重要的指導(dǎo)意義。隨著對(duì)帕利泊芬治療前列腺癌的藥理作用和機(jī)制的深入研究以及在臨床上的應(yīng)用，人們對(duì)PDT的認(rèn)知將更為全面，可以相信，未來(lái)將會(huì)有更多的PS被研發(fā)出來(lái)，在腫瘤的臨床治療中發(fā)揮重要作用。

圖5 帕利泊芬給藥后在小鼠體內(nèi)的生物分布Figure 5 Biodistribution of padeliporfin in mice after administration