禽流感病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

王楷宬，王素春，朱 琳，仲煥香，黃保續(xù)

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2. 南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇南京 210095）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）為單股負鏈RNA病毒，由 8個獨立的RNA節(jié)段組成。該病毒的顯著生物學特征之一是亞型眾多、變異頻繁。迄今為止從禽類體內(nèi)已經(jīng)分離到上千種毒力各異的毒株，根據(jù)病毒粒子表面的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性差異，將其分為18種HA亞型（H1～H18）和11種 NA 亞型（N1～N11）[1-3]。

禽流感分布很廣，世界各地均有分離出該病病原的報道。其病原致病性有高致病性和低致病性之分。禽流感的發(fā)生給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重危害。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）報告，2003—2004年禽流感在越南暴發(fā)導致的損失預計為該國GDP的0.3%～1.8%[4]。禽流感暴發(fā)對我國家禽養(yǎng)殖農(nóng)戶的生計也造成了巨大沖擊，農(nóng)戶家禽養(yǎng)殖收入和家庭收入均顯著下降。在控制其他變量的條件下，1次禽流感發(fā)生會造成農(nóng)戶人均家禽養(yǎng)殖收入平均降低65%，農(nóng)民人均收入下降29%[5]。

同亞型毒株對宿主的致病力差異顯著。在所有HA亞型中，只有H5和H7亞型對禽是高致病性的，稱為高致病性禽流感（High pathogenic avian in fluenza，HPAI）。該類病毒可引起雞群100%死亡，因而HPAI被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報動物疫病。此外，禽流感的危害不僅是對養(yǎng)禽業(yè)的破壞，還對人類健康構(gòu)成潛在威脅[6-7]。

快速檢測是有效防控動物和人類禽流感的關(guān)鍵因素之一。為滿足AIV的高通快速檢測與應(yīng)急響應(yīng)，本研究建立了AIV實時熒光定量RT-PCR檢測方法，評估了該方法的檢測下限與特異性，并進行了臨床應(yīng)用檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑：均購自Life technologies公司；超凈工作臺：美國Forma Scientific公司產(chǎn)品；移液器：Eppendorf公司產(chǎn)品；孵化器：德州誠信孵化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高速臺式離心機：德國Heraeus Biofuge primoR公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀：Bio-Rad CFX96 Realtime PCR System；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、Primescript One step RTPCR Kit Ver.2：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取試劑盒：德國QIAGEN公司產(chǎn)品；Low-Pro file PCR Tubes 8-tube strip：BIO-RAD公 司 產(chǎn) 品；Optically clear flat 8 Cap Strips：Thermo Scientific公司產(chǎn)品；異丙醇、無水乙醇、RNaseA等：均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 毒株與核酸提取

各亞型流感病毒、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）、 傳 染 性 喉氣 管 炎 病 毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）毒株：由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心禽病監(jiān)測室保存，毒株詳細信息見表1。按照說明書操作，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，并使用Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑測定RNA濃度。

1.3 引物與探針篩選

從GenBank中下載不同亞型、不同國家、不同分離時間的AIV毒株M基因序列共1 641條，采用MEGA 6.0[8-9]進行序列比對，選取保守區(qū)域進行熒光定量檢測引物和探針設(shè)計，并對多條引物、探針進行組合、篩選與檢驗，以期篩選出最優(yōu)引物和探針。

1.4 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

配制熒光定量RT-PCR反應(yīng)液，每管25 μL：含 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL，5 U/μL TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，10 pmol/μL M forward、M reverse和 M probe 各 0.5 μL，RNase Free dH2O 8.0 μL，待檢測樣品RNA模板2 μL。將檢測反應(yīng)條件設(shè)置為：第1階段，42 ℃/5 min；第2階段，95 ℃/10 s；第3階段，95 ℃/5 s，60 ℃/20 s（收集熒光），40個循環(huán)。無Ct值并且無擴增曲線時，樣品判為陰性；Ct值≤36，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，樣品判為陽性。

1.5 特異性與靈敏度評估

采用上述反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，檢測表1中的病毒RNA，以評估該檢測方法的特異性。提取的核酸經(jīng)Qubit核酸濃度測定儀測定RNA濃度后，將此病毒RNA稀釋成1 ng/μL，再10倍梯度稀釋成 10-1～10-6ng/μL；分別取 2 μL 作為反應(yīng)模板，按照前述加樣方法進行實時熒光定量RT-PCR核酸擴增。

表1 禽流感病毒毒株信息

1.6 臨床樣品檢測

采集我國華東某市4個養(yǎng)雞場的雞咽喉拭子共94份，置于含有10%甘油和抗生素（含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 000 IU/mL、制霉菌素1 000 IU/mL，BSA 5 mg/mL） 的 PBS（pH7.2）緩沖液中，-80 ℃保存。將采集的樣品渦旋混勻后，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min；取上清，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒核酸[10]，-80 ℃保存。使用96孔反應(yīng)管加入上述反應(yīng)體系，分別加入待檢樣品RNA進行檢測。用該方法與農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《禽流感病毒RT-PCR檢測方法》（NY/T772—2013）中的方法，同時對94份臨床樣品進行檢測，對比檢測結(jié)果，分析本試驗建立方法在臨床檢測中的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與探針篩選

最終篩選出最適合的引物（M forward、M reverse）和探針（M probe），序列已申請發(fā)明專利（表2），其中M probe為TaqMan熒光探針，標記ROX熒光。

表2 最適引物及探針序列

2.2 特異性與靈敏度

結(jié)果顯示，除了各亞型AIV RNA模板對應(yīng)的試驗組出現(xiàn)了正常熒光檢測曲線外，其他非特異性病毒的試驗組及陰性對照組均未出現(xiàn)擴增曲線。結(jié)果表明，此方法不與其他相關(guān)病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，可以實現(xiàn)AIV的特異性檢測（圖1）。

本研究篩選的引物和探針組合能夠保證檢測時的靈敏性，檢測靈敏度為RNA終濃度10-4ng/μL（圖2）。

圖1 AIV實時熒光定量RT-PCR檢測特異性試驗結(jié)果

圖2 AIV實時熒光定量RT-PCR檢測靈敏度試驗結(jié)果

2.3 臨床樣品檢測

用本試驗建立的AIV實時熒光定量RT-PCR檢測方法和農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T772—2013中的傳統(tǒng)檢測方法，對94份臨床樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法結(jié)果一致，陽性符合率為100%（表3）。共檢測96份樣品，其中94份臨床拭子樣品、1個AIV陽性對照、1個AIV陰性對照，而本試驗建立的實時熒光定量RT-PCR檢測方法耗時約1 h。部分檢測結(jié)果見圖3。

3 討論

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR）是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且靈敏度高，特異性和可靠性更強，能實現(xiàn)多重反應(yīng)，自動化程度高，無污染性，同時具有實時性和準確性的優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領(lǐng)域[11]。

本研究在分析大量AIV流行毒株序列基礎(chǔ)上，篩選出一組特異性好、檢測下限達10-4ng/μL的探針、引物，建立了高通量檢測方法，并應(yīng)用于臨床檢測。該方法能夠檢測各亞型AIV，與農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T772—2013中的傳統(tǒng)方法進行對比試驗，發(fā)現(xiàn)陽性符合率達100%，且能在1 h內(nèi)完成對未經(jīng)培養(yǎng)臨床樣品的高通量檢測，能夠滿足大規(guī)模流行病學調(diào)查的需要。

表3 臨床樣品檢測結(jié)果

圖3 部分臨床樣品實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果

近年來，實時熒光定量RT-PCR檢測已逐漸使用TaqMan熒光探針代替SYBR Green染色，使用TaqMan熒光探針，較傳統(tǒng)SYBR Green染色法，可避免污染并且能夠提高特異性。目前關(guān)于檢測所有亞型AIV的TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法的報道較少。Nagy等[12]曾建立一種使用TaqMan熒光探針的AIV實時熒光定量RT-PCR檢測方法，其檢測下限能夠達到5拷貝/反應(yīng)，也能達到良好的檢測效果。本研究使用TaqMan熒光探針，檢測靈敏度也達到了10-4ng/μL，特異性也較好。

流感病毒曾在20世紀引起4次疫病大流行，包括1957年的H2N2、1968年的H3N2以及1918年和2009年的H1N1，導致數(shù)百萬人死亡。1997年暴發(fā)的H5N1禽流感疫情造成18人感染、6人死亡，這也是全球首次發(fā)現(xiàn)AIV能夠傳染給人[13]。我國被認為是容易產(chǎn)生新型流感病毒的區(qū)域[14]。新型或變異AIV目前在我國廣泛存在，有些甚至會導致人類感染，如H5N1、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8和H5N6等[15]。因此，建立能檢測所有亞型AIV的檢測方法有利于及時發(fā)現(xiàn)這些變異和新型AIV毒株。