EFhd1蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

許立芹 呂夢源 馮 健

肺癌是一種起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例超過160萬，每年有130萬人死于該病，是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率及病死率均位居首位的腫瘤疾病，其診療已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點[1-2]。肺癌根據(jù)其組織學(xué)特征，一般分為小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)兩種類型，其中NSCLC約占80%～85%[3]。由于缺乏特征性的臨床表現(xiàn)，確診的患者約有80%已處于肺癌晚期，多已錯過最佳的手術(shù)治療時機，然而即便是早期發(fā)現(xiàn)并行手術(shù)切除腫瘤的患者，由于腫瘤的轉(zhuǎn)移性質(zhì)，癥狀可能很快復(fù)發(fā)[4]。肺癌的5年生存率只有16.8%左右[5]。如今靶向治療在肺癌領(lǐng)域發(fā)展迅速，在對EGFR、ALK突變敏感的NSCLC中顯示出高達(dá)70%的臨床有效性，但后期耐藥不可避免，中位耐藥時間9～13個月，新一代酪氨酸激酶抑制劑(TKI)類藥物仍同樣面臨再次突變耐藥的問題[6-7]。腫瘤耐藥是當(dāng)今臨床面臨的重點問題，雖然已有新型靶向藥物的研發(fā)、免疫療法等治療策略，但這一問題仍未得到妥善解決。因此，臨床迫切需要不斷探索新的治療靶點，進(jìn)一步提高患者生存質(zhì)量，改善預(yù)后。

鈣是人體內(nèi)最重要的元素之一，廣泛分布于人體各組織器官中，細(xì)胞內(nèi)的許多生理反應(yīng)以及細(xì)胞間的交流都是由細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號引起的。這些過程包括轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、分化、細(xì)胞運動/遷移、程序性細(xì)胞死亡、肌肉收縮/松弛、神經(jīng)傳遞、分泌、學(xué)習(xí)和記憶[8]。雖然只有一小部分離子鈣(即1%)具有生理活性，但它在生物系統(tǒng)中起著最重要的作用，被認(rèn)為是一種準(zhǔn)通用信號分子[9]。基于對鈣信號傳導(dǎo)、鈣穩(wěn)態(tài)失衡的研究，目前認(rèn)為這種普遍存在的二價陽離子以鈣儲存依賴性和鈣通量依賴性兩種途徑參與了癌癥的發(fā)生、促進(jìn)和發(fā)展[10-11]。鈣離子結(jié)合蛋白是一類包含200多個成員的蛋白超家族，該家族成員對鈣離子高度敏感，與鈣離子結(jié)合后，促使蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，從而能與多種蛋白質(zhì)相互作用，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。目前已證實鈣離子結(jié)合蛋白與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，如心肌病、高血壓病、神經(jīng)性老年退化性疾病以及多種腫瘤，包括乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、肺癌、黑色素瘤等。EFhd家族包括EFhd1和EFhd2兩名成員，是EF家族中保守且高度同源的鈣結(jié)合蛋白，由一個n端無序區(qū)域、兩個Ca2+結(jié)合EF-hands中心區(qū)域和一個c端卷曲線圈區(qū)域組成，兩者在AA 20-80區(qū)域差別最大[12-14]。有研究證明，EFhd1在腎癌細(xì)胞 (RCC)中的表達(dá)受到抑制，并可作為HNF4A的一個靶基因[15-16]。相反，EFhd1在乳腺癌及結(jié)直腸癌的異常DNA甲基化中高表達(dá)，同時在Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤患者的腫瘤[18]組織中高水平表達(dá)并與患者的生存期縮短顯著相關(guān)，提示預(yù)后不良[17-18]。另外，有實驗證明，EFhd1在胰腺癌中的表達(dá)受SOD2，一種能使超氧化物歧化酶失活以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的線粒體酶的調(diào)控[19]。

目前，EFhd1基因在肺癌的作用尚未有研究報道，本文選取臨床病理標(biāo)本，通過免疫組化方法檢測其在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，并分析其與肺癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，同時分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，旨在探討其作為肺癌預(yù)后判斷和潛在基因治療靶點的可能性。

資料與方法

一、研究資料

選擇南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科檔案庫中心胸外科2004年1月至2011年4月間收治的NSCLC手術(shù)患者標(biāo)本，共獲得178例腫瘤組織蠟塊標(biāo)本及51例癌旁正常組織蠟塊標(biāo)本。臨床資料包括性別、年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類型、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，術(shù)后隨訪滿5年，隨訪資料完整，期間失訪或死亡原因為非肺癌的患者被排除。所有患者在術(shù)前均未接受新輔助放化療、靶向治療及免疫治療。納入實驗的178例患者的，癌組織其中男性137例，女性41例，平均年齡為62.61歲；癌旁組織中男性33例，女性18例，平均年齡為62.39歲；按照2009年第七版NSCLC病理診斷TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：癌組織 T1期59例；T2期99例；T3-4期共20例；癌旁組織 T1期24例；T2期24例；T3～4期共3例；癌組織中 鱗癌96例，腺癌55例，其他類型27例；組織分化程度劃分為低分化、中分化、高分化和未知，癌組織依次為43例、30例、97例、8例；癌旁組織依次為4例、11例、35例、1例；腫瘤直徑以3 cm為界分為兩組，癌組織 ≤3 cm有82例，>3 cm有96例；癌旁組織 ≤3 cm有0例，>3 cm有51例。本文經(jīng)過南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、研究方法

1. 制備組織芯片： 腫瘤組織178例和癌旁正常組織51例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理診斷為NSCLC。標(biāo)本被制作成厚度為4 μm厚的組織芯片，置于冰箱4 ℃冷藏室備用。

2. 免疫組化方法： (1)烤片：將組織芯片置于60 ℃恒溫箱中，烘烤20 min；(2)脫蠟水化:將烘烤后組織芯片浸于二甲苯中脫蠟10 min×3次，取出后梯度乙醇水化，100%、90%、80%、70%由高到低每缸浸泡5 min，蒸餾水清洗片刻；(3)抗原修復(fù)：將組織芯片放入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，放入高壓鍋中，待煮沸后沸騰5 min，室溫冷卻。蒸餾水洗3 min×3次，PBS水洗5 min×3次；(4)阻斷：在組織芯片中滴加3%過氧化氫，避光室溫孵育10 min，PBS水洗5 min×3次；(5)在組織芯片上滴加山羊血清封閉液體150 μl，在室溫條件下，孵育1 h，甩去多余液體；(6)150 μl兔抗人EFhd1單克隆抗體工作液，在4 ℃條件下過夜，然后用PBS水洗5 min×3次；(7)滴加150 μl山羊抗兔通用抗體工作液，37 ℃孵育，20 min。PBS水洗5 min×3次；(8)顯色劑顯色：滴加DAB顯色，鏡下觀察細(xì)胞膜染色即可，蒸餾水清洗；(9)復(fù)染細(xì)胞核：用蘇木素復(fù)染2 min，再使用蒸餾水水洗至水澄清。1%鹽酸乙醇分色2 s，水洗；(10)脫水透明；(11)封片：將組織芯片風(fēng)干后，滴加中性樹膠，封片。

3. 觀察標(biāo)準(zhǔn)： 免疫組化結(jié)果由全自動病理成像系統(tǒng)成像，采用雙盲法評分，由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師對組織芯片上每個位點的染色情況進(jìn)行評價，觀察EFhd1蛋白的分布，分別記錄染色陽性細(xì)胞百分比及強度。主要表達(dá)部位：EFhd1陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，出現(xiàn)黃色、黃褐色、棕色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片隨機選擇10個高倍視野(×400)，每個視野至少查1 000個細(xì)胞。根據(jù)切片中染色強弱程度評分：沒有染色為0分；淺黃色為1分；黃褐色為2分；棕色為3分。根據(jù)切片中陽性細(xì)胞比率評分如下：少于5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；大于75%，4分。染色強弱程度所得分加上陽性細(xì)胞比率所得分為總得分，最小值為0分，最大值為12分。例如，一個標(biāo)本包含75%的腫瘤細(xì)胞中等強度染色(3×2=6分)，另外的25%的腫瘤細(xì)胞是弱強度的(1×1=1)最后得到的結(jié)果是6+1=7。數(shù)據(jù)分析的時候，0～7分被認(rèn)為是低表達(dá)而8～12分被認(rèn)為是高表達(dá)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

所獲數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，癌組織與癌旁組織中EFhd1蛋白表達(dá)及EFhd1表達(dá)與各臨床參數(shù)間的分析采用χ2檢驗；采用Cox單因素及多因素分析臨床病理參數(shù)與預(yù)后之間的關(guān)系，Kaplan-Meier法制作生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、EFhd1在NSCLC組織中的表達(dá)

免疫組化方法檢測了EFhd1蛋白在NSCLC組織及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，EFhd1蛋白陽性表達(dá)于NSCLC組織細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色、黃褐色、棕色顆粒，見圖1；EFhd1蛋白在NSCLC組織中高表達(dá)占比43.3%(77/178)，癌旁組織中高表達(dá)占比僅有2.0%(1/51)，癌組織中EFhd1高表達(dá)者顯著高于癌旁組織(P=0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1免疫組化方法檢測EFhd1在NSCLC組織中的表達(dá)；注：A：鱗癌(×40)；B：腺癌(×40)；C：癌旁組織(×40)

二、EFhd1蛋白的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

EFhd1的高表達(dá)與腫瘤T分期(P=0.025)有關(guān)，而與患者年齡(P=0.187)、性別(P=0.533)、組織學(xué)類型(P=0.385)、分化程度(P=0.920)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.312)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.381)、TNM分期(P=0.236)及腫瘤大小(P=0.228)無關(guān)，見表1。

表1 癌組織中EFhd1蛋白表達(dá)程度的單因素分析[n(%)]

三、單因素及多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示TNM分期(P=0.001)、T分期(P=0.006)、N分期(P=0. 0.001)與NSCLC患者的預(yù)后相關(guān)，而EFhd1表達(dá)程度與預(yù)后無關(guān)(P>0.05)。為了排除混雜因素的影響，納入Cox比例風(fēng)險多因素模型分析，結(jié)果證實EFhd1表達(dá)程度以及TNM分期為獨立預(yù)后因素 (P<0.05)，見表2。

表2 NSCLC患者預(yù)后單因素和多因素分析

四、生存分析

生存曲線顯示EFhd1高表達(dá)對應(yīng)患者的短生存期和較差預(yù)后，TNM分期越晚則生存時間越短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與、多信號通路交錯調(diào)控的復(fù)雜過程，近幾年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，及對腫瘤發(fā)展機制研究的不斷深入，越來越多的驅(qū)動基因及抑癌基因被發(fā)現(xiàn)。分子靶向治療除了可以直接對促進(jìn)腫瘤生長的特異性細(xì)胞受體及信號傳導(dǎo)通道發(fā)揮作用，還可以參與新生血管形成及細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

圖2生存曲線

本文探討了EF手型鈣結(jié)合蛋白家族成員之一EFhd1在NSCLC中的表達(dá)及臨床意義。通過采用高通量組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化法檢測EFhd1在NSCLC和癌旁組織的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)EFhd1陽性表達(dá)主要在NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，結(jié)果顯示EFhd1蛋白在NSCLC癌組織表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Davidson等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EFhd1在乳腺癌中表達(dá)增高，在肺腺癌的胸腔積液中，EFhd1的表達(dá)無明顯上調(diào)，產(chǎn)生這種不一致的原因一方面可能是在實體腫瘤中存在大量基質(zhì)相關(guān)基因，而滲出標(biāo)本中沒有這些基因，另一方面可能是滲出液與原發(fā)性腫瘤中的癌細(xì)胞之間的具有真實的分子差異。有研究表明，對原發(fā)性乳腺癌和乳腺癌滲出物的陣列分析支持這兩個因素對基因表達(dá)差異有影響[20]?？紤]也可能與胸腔積液中細(xì)胞數(shù)較少有關(guān)，無法全面表現(xiàn)出該基因的表達(dá)，而直接采用腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行實驗，因此得到陽性結(jié)論。Takane等[21]進(jìn)行了甲基化DNA免疫沉淀芯片分析，并結(jié)合基因再表達(dá)分析，得出在結(jié)直腸癌異常甲基化DNA中EFhd1存在表達(dá)，并可聯(lián)合PPP1R3C作為早期診斷的有效生物學(xué)標(biāo)記物。相反的是，在腎癌細(xì)胞中EFhd1的表達(dá)程度較正常腎組織減少[15]。研究發(fā)現(xiàn)EFhd1可能是HNF4A的一個作用靶點，而HNF4A具有腫瘤抑制功能，如果誘導(dǎo)EFhd1在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)反而可以增加腫瘤增殖，可見EFhd1本身的作用似乎與HNF4A的增殖抑制相抗衡[16]。同時猜測EFhd1的表達(dá)還可能與腫瘤類型、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境等因素有關(guān)。

本文運用單因素及多因素分析了EFhd1的表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后之間的相關(guān)性。單因素結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNM分期、T分期、N分期與患者的預(yù)后有關(guān)，但是EFhd1表達(dá)程度與生存預(yù)后無關(guān)。本文再一次把全部臨床病理參數(shù)納入Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果提示TNM分期和EFhd1的表達(dá)程度是預(yù)后的獨立危險因子。生存曲線也證實EFhd1高表達(dá)對應(yīng)患者的短生存期和較差預(yù)后， TNM分期越晚則生存時間越短，該研究結(jié)果與Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤組織中所測的結(jié)果相一致。本文在單因素分析中，EFhd1的表達(dá)與生存預(yù)后無關(guān)，考慮可能是單因素分析中未能排除混雜因素的交互作用對統(tǒng)計結(jié)果的影響，因此應(yīng)以多因素模型分析結(jié)果為準(zhǔn)。

EFhd1是一種定位于線粒體內(nèi)膜的鈣結(jié)合蛋白，是參與B細(xì)胞識別和控制早期B細(xì)胞發(fā)育的TFs的靶基因。Urbanczyk等[22]在一項關(guān)于早期B細(xì)胞發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，在從pro-B到pre-B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中，后者需要下調(diào)EFhd1的表達(dá)，而pre-B細(xì)胞中SOD2的上調(diào)與其抑制EFhd1表達(dá)的功能密切相關(guān)，這與在胰腺癌中所觀察到的結(jié)果相一致[19,23]。EFhd1的表達(dá)顯著增強了PGC-1α，PGC-1α是參與線粒體生物發(fā)生的PPAR的共同激活劑，提示EFhd1表達(dá)有利于線粒體作為優(yōu)先的能量來源。線粒體功能障礙是癌細(xì)胞的主要特征之一，線粒體功能障礙導(dǎo)致的代謝異常、ROS生成增加、mtDNA基因突變以及鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡廣泛參與了癌細(xì)胞的無限增殖、凋亡抵抗、侵襲及轉(zhuǎn)移。研究表明，EFhd1可以上調(diào)PGC-1α的表達(dá)，而PGC-1α超表達(dá)在主要骨胳肌管和Hela細(xì)胞增加了線粒體體積，導(dǎo)致線粒體Ca2+積累過程中線粒體Ca2+濃度的減少，這一現(xiàn)象可能導(dǎo)致細(xì)胞對Ca2+介導(dǎo)的凋亡敏感性降低[24]。另一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，線粒體中的EFhd 1與雌激素受體α鏈(ESR 1)相互作用，而ESR 1和PGC-1α存在雙向依賴[25]。因此EFhd 1可能通過ESR1影響PGC-1α及其靶基因的表達(dá)，進(jìn)一步的實驗表明，在轉(zhuǎn)化的pro-B細(xì)胞系38B9中通過Crispr-Cas9介導(dǎo)的EFhd1敲除及其shRNA介導(dǎo)的基因敲除，可導(dǎo)致糖酵解、糖酵解速率以及糖酵解能力儲備的增加。因此，EFhd1上調(diào)PGC-1α及其對糖酵解的負(fù)作用表明EFhd1是一種潛在的分解代謝因子。此外，Tominaga等研究認(rèn)為EFhd 1參與神經(jīng)元的分化，并通過線粒體發(fā)揮作用。

近年來，一種新型的動態(tài)線粒體活動被研究發(fā)現(xiàn)，即線粒體閃光，這是一種在健康和疾病狀態(tài)下控制線粒體代謝和信號傳遞的具有生物能量的線粒體事件，其既是一個耗能的過程，又存在對細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷的風(fēng)險，它們廣泛存在于從蠕蟲到人類的各種不同種類的細(xì)胞和組織中。線粒體閃光發(fā)生率受到代謝狀態(tài)、氧化應(yīng)激、發(fā)育階段和衰老等因素的調(diào)控，并與線粒體功能以及其他核心線粒體信號密切相關(guān)。研究表明，EFhd1通過選擇性地調(diào)控Ca2+來調(diào)節(jié)線粒體閃光，而不影響線粒體Ca2+的升高、線粒體ROS的產(chǎn)生和線粒體呼吸功能。他們生成了一個EFhd1突變體(mtEFhd1)，其兩個EF-hand結(jié)構(gòu)域均被破壞，結(jié)果完全喪失了調(diào)節(jié)線粒體閃光活性的能力。這一結(jié)果表明EF-hand結(jié)構(gòu)域是EFhd1激活Ca2+依賴型線粒體閃光所必需的，從而證實了EFhd1作為線粒體Ca2+傳感器激活Ca2+依賴型線粒體閃光的觀點。

綜上所述，本文探討了EFhd1在NSCLC中的表達(dá)及其臨床意義，結(jié)果表明EFhd1在NSCLC中的表達(dá)遠(yuǎn)較癌旁組織明顯增高，且其高表達(dá)與NSCLC患者的不良預(yù)后可能有關(guān)，提示EFhd1有可能作為臨床檢測或聯(lián)合檢測的指標(biāo)，提高臨床診斷率，可能作為肺癌精準(zhǔn)治療的潛在靶點之一，其具體作用機制及通路仍需后續(xù)大量的基礎(chǔ)及臨床實驗研究進(jìn)行驗證。