DDX5 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖及凋亡的影響

陳祝鋒 王曉艷

作者單位：710038 西安，中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科(陳祝鋒)；150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬 醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(王曉艷)

有研究證實 Th17 細胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者的滑膜炎癥中發(fā)揮著重要作用[1]。目前發(fā)現(xiàn)，DDX5 和 lncRMRP 作為 ROR γt 的新型配體，在誘導(dǎo) Th17 細胞成熟中發(fā)揮重要作 用[2]。DDX5 屬于 DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)box 蛋白家族成員，是一類進化高度保守的 ATP 依賴 RNA 解旋酶，參與 RNA 合成、剪切、轉(zhuǎn)運各個方面。新近的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中存在 DDX5 表達上調(diào)，通過抑制其表達后可減少腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡[3-10]，然而 DDX5 在 RA 中的研究暫無報道，因此本研究擬探討 DDX5 在 RA 滑膜成纖維細胞中的表達及其對細胞增殖的影響。

材料與方法

一、材料

siRNA、轉(zhuǎn)染試劑盒購自廣東銳博生物技術(shù)有限公司；四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司(11011-8611)；TRIZOL 購自美國 Invitrogen 公司(15596026)；青霉素溶液－鏈霉素溶液(碧云天公司 C0222)、胰蛋白酶購自碧云天公司(C0201)；DMEM / F12 購自美國 HyClone 公司(AC10447353)；引物由哈爾濱欣科瑞公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 abm 公司(G492)，SYBR Green PCR 試劑盒購自 abm 公司(MasterMix-S)；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司(C1063)；I型膠原酶購自美國 Sigma 公司(C0130)；CCK8 試劑盒購自 MEC 公司(HY-K0301)。倒置顯微鏡(蔡司 Primovert Hdcam)； Real-time PCR 儀(Rotor Gene Q2 plex)；PCR 擴增儀(Bio-radPIC-2005)、流式細胞儀(貝克曼 Epics XL-MCL)；細胞孵箱、超凈工作臺(美國 Thermo公司)；高速低溫離心機(貝克曼 GS-15R)；酶標(biāo)儀(帝肯 Infinite M200 Pro)；培養(yǎng)瓶(美國 Corning 公司，430639)。

二、方法

1. 滑膜成纖維細胞原代培養(yǎng)：取行關(guān)節(jié)置換術(shù)的 RA 患者的滑膜組織，放入含 1% 雙抗的 PBS 冰水中清洗 2 次，用解剖剪仔細剔除脂肪組織，然后將組織放入含有 4 mg / ml I 型膠原酶的 DMEM / F12 中，將組織剪成 1 mm3的碎片，然后轉(zhuǎn)移至 15 ml 離心管，37 ℃ 孵育 120 min(每隔 15 min 搖晃幾次)，細胞懸液經(jīng) 70 μm 細胞濾網(wǎng)過濾，離心半徑 7.5 cm，1000 r / min，離心 5 min，DMEM / F12 洗滌 2 次，細胞最終懸浮于含 10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素溶液的 DMEM / F12 中，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。每隔 3～5 天換液 1 次，第 3～6 代細胞用于本實驗。

2. RT-qPCR：收取行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)中取下的 RA 患者滑膜組織(8 例)及行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的半月板損傷患者的滑膜組織做對照(3 例)，迅速放入液氮中帶回實驗室。用液氮研磨滑膜組織，Trizol 法提取總 RNA，比色杯測 RNA 濃度，用 2 μl RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄 20 μl 體系：RNA Template 2 μg， AccuRT Reaction Mix(4X)2 μg，Nucleose-free H2O up to a total volume of 8 μl，室溫放置 5 min，AccuRT Reaction Stopper(5X)2 μl，5X All-In-One RT MasterMix 4 μl，Nuclease-free H2O 6 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15min，85 ℃ 5 min。PCR 反應(yīng)體系：EvaGreen 2X qPCR MasterMix 5 μl，F(xiàn)orward Primer(10 μM)0.3 μl，Reverse Primer(10 μM)0.3 μl，Template DNA＜＝500 ng / reaction，Nuclease-free H2O to 10 μl，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 60 sec，40 cycles。采用 2-△△CT法，設(shè)對照組表達為 1，算出 fold change。引物序列：GAPDH，forward：5’-GGAG CGAGATCCCTCCAAAAT-3’，reverse：5’-GGCTGTT GTCATACTTCTCATGG-3’；DDX5，forward：5’-GC ACAGCACAAGAGGTGGAA-3’，reverse：5’-TCCCT GAGCTTGAATAGCAGT-3’。

3. siRNA 轉(zhuǎn)染：用廣東銳博生物的轉(zhuǎn)染試劑盒(R0510)，操作按照說明書進行，應(yīng)用 1× riboFECTTM CP Buffer 稀釋 siRNA，混勻加入 3 μl riboFECTTM CP Reagent，制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫孵育 10 min，然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入適量無雙抗完全培養(yǎng)基中混勻，將培養(yǎng)版放置 37 ℃ 孵箱培養(yǎng) 24～72 h。

4. CCK8 測定細胞活性：將細胞濃度調(diào)整為 1×105/ ml，每孔 100 μl 接種于 96 孔板上，siCtrl 組和 siDDX5 組分別加入不同 siRNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，每組設(shè) 6 個重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng) 24～72 h，加人 CCK8 10 μl，放置于孵箱內(nèi)培養(yǎng) 2 h，用酶標(biāo)儀檢測 450 nm處的吸光度值(OD450)。

5. 流式細胞儀測定細胞凋亡：取轉(zhuǎn)染后的兩組細胞，將培養(yǎng)液吸出至 15 ml 離心管內(nèi)，PBS 洗滌 1 次，然后加用 0.25% 胰酶消化 2 min，加入原培養(yǎng)液終止消化，將細胞輕輕吹下，收集至 15 ml 離心管內(nèi)離心(離心半徑 7.5 cm，1000 r / min，離心 5 min)，棄上清，加入 PBS，調(diào)整細胞數(shù)為 1×l06/ ml，取 1 ml 細胞懸液 1000 r / min 離心 5 min，棄上清，加入 5 μl Annexin V-FITC，10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育 10 min 后，上流式細胞儀檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，設(shè)定檢驗水準(zhǔn) α＝0.05，統(tǒng)計方法應(yīng)用t檢驗，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RA 與正常對照組滑膜中 DDX5 的表達

設(shè)正常對照組表達為 1，RA 組滑膜組織中 DDX5 mRNA 的表達為 1.61±0.63，P＜0.05，t＝4.56(圖 1)。

二、轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，RA 滑膜成纖維細胞增殖情況

CCK8 檢測 RA 滑膜成纖維細胞的活性顯示，轉(zhuǎn)染 siCtrl 后，24 h，48 h，72 h OD450 分別為 ( 0.71±0.008，0.83±0.02，0.89±0.009)，轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，24 h，48 h，72 h OD450 分別為(0.7± 0.02，0.79±0.01，0.81±0.02)，結(jié)果顯示 72 h 兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，t＝5.5)(圖 2)。

圖1 RA 與正常對照組滑膜中 DDX5 的表達Fig.1 The expression of DNM1L in synovial tissues of RA and normal control

圖2 轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，RA 滑膜成纖維細胞增殖情況Fig.2 The expression of DNM1L in synovial tissues of RA and normal control

三、轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，RA 滑膜成纖維細胞凋亡情況

Annexin V-FITC 檢測 RA 滑膜成纖維細胞凋亡顯示，轉(zhuǎn)染 siCtrl 72 h 后，凋亡細胞比率為(13.4± 1.44)%，轉(zhuǎn)染 siDDX5 72 h 后，凋亡細胞比率為(21.7±2.12)，P＜0.05，t＝5.35(圖 3)。

討 論

RA 主要病理改變?yōu)榛ぱ祝そM織增生，滑膜細胞包括滑膜成纖維細胞和滑膜巨噬細胞，滑膜成纖維細胞在滑膜細胞增殖、遷移以及促炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。眾所周知，Th17 細胞在 RA 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，通過阻斷 Th17 細胞的作用有望達到治療疾病的目的。在誘導(dǎo) Th17 細胞成熟的過程中，ROR-γt 扮演了重要作用。ROR-γt 的兩個配偶體：DDX5 和 lncRMRP 的共同協(xié)作，控制了 Th17 細胞的成熟，DDX5 可以促進 RMRP 改變形狀并且吸附至 ROR-γt 上，從而形成一種復(fù)合體吸附到靶點位置上促進基因的開啟。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)這種機制不存在時，患自身免疫疾病的小鼠模型(EAE)疾病減輕[2]。

DDX5 在多種腫瘤中高表達。Xue 等[3]的研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中 DDX5 表達增高，抑制其表達后肝癌細胞增殖遷移降低，凋亡增加。有研究表明，DDX5 通過 mTOR 信號通路促進胃癌細胞增殖[10]。此外，DDX5 通過 beta-catenin 信號通路促進非小細胞肺癌增殖[5]。乳腺癌中，DDX5 高表達，通過增加促癌表達加重疾病進展[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用白藜蘆醇(resveratrol)后，可通過減少 DDX5 產(chǎn)生，誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡[8]。同時，DDX5 在食管癌中表達增高，阻斷 DDX5 表達后可抑制食管癌細胞增殖和遷移[6]。此外，最近研究發(fā)現(xiàn) DDX5 可通過減少病毒正鏈 RNA 的負鏈合成來增強丙型肝炎病毒(HCV)病毒復(fù)制[12]。最近報道指出，DDX5 以 stat3 依賴性方式增強結(jié)直腸癌細胞增殖和侵襲[9]?？梢姡谀[瘤中，DDX5 可作為有效的治療靶點緩解多種腫瘤疾病的進展，然而關(guān)于其在自身免疫性疾病中的作用仍未可知。

圖3 轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，RA 滑膜成纖維細胞凋亡情況Fig.3 Cell apoptosis after the transfection of siDDX5

本研究結(jié)果顯示與腫瘤一樣，RA 滑膜組織同樣存在 DDX5 表達增多現(xiàn)象，為進一步研究 DDX5 對 RA 滑膜成纖維細胞的影響，本研究應(yīng)用小干擾 RNA 轉(zhuǎn)染滑膜成纖維細胞，并進一步檢測其對細胞增殖、凋亡的影響。結(jié)果顯示沉默 DDX5 表達后，RA 滑膜成纖維細胞增殖減低，且凋亡增加。提示 DDX5 可能參與了 RA 滑膜炎的發(fā)生發(fā)展，通過抑制 DDX5 的表達，有望達到治療 RA 的目的。然而關(guān)于 DDX5 對 RA 局部炎癥因子及信號通路的影響以及對關(guān)節(jié)炎模型疾病的影響，有待進一步研究。

綜上所述，本研究首次證實，通過阻斷 RA 滑膜局部 DDX5 的表達，有望達到治療 RA 的目的。