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    高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地山海螺中黨參炔苷的含量及指紋圖譜

    2019-04-23 03:31:02王景雁馬秉智王海洋
    關(guān)鍵詞:海螺黨參產(chǎn)地

    王景雁,馬秉智,蘭 頤,王海洋,李 棟,赫 軍,陸 進(jìn),劉 曉?

    (1.中日友好醫(yī)院 藥學(xué)部,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,北京 100102;3.山東達(dá)因海洋生物制藥股份有限公司,威海 264300)

    山海螺為桔??浦参镅蛉镃odonopsis lanceolata(Sieb.et Zucc)Trautv 的干燥根。 味甘性溫,歸心、肺經(jīng),功能益氣養(yǎng)陰、解毒消腫、排膿、通乳。 用于神疲乏力、頭暈頭痛、肺癰、瘡癤腫毒、喉蛾、瘰疬、產(chǎn)后乳少、白帶、毒蛇咬傷[1]。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,山海螺具有耐缺氧和抗疲勞[2,3]及增強(qiáng)免疫的作用[4],鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥和提高記憶力的作用[5],抗腫瘤作用[6],抗炎、抗菌和鎮(zhèn)咳作用[7],抗氧化[8,9],催乳作用[10],抗突變活性和調(diào)節(jié)血脂作用[11,12],保肝醒酒作用[13]。筆者通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),山海螺藥材中黨參炔苷含量很高[14],而且同屬植物黨參也以黨參炔苷作為質(zhì)控指標(biāo)[15],故本文以黨參炔苷作為質(zhì)控指標(biāo),采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定了13 個(gè)不同產(chǎn)地山海螺樣品,為山海螺的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    1 材料

    1.1 儀器

    Agilent1260 高效液相色譜儀 (包括DAD 檢測(cè)器,四元高壓梯度泵,自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱,美國(guó)安捷倫公司);Sartorius CPA225D 型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);DT5-3 型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋 (北京科偉家興儀器有限公司)。

    1.2 藥材與試劑

    山海螺樣品產(chǎn)地見表1,鑒定為桔??浦参镅蛉镃ondonopsis lanceolata (Sieb.et Zucc.)Trautv.的干燥根。 黨參炔苷對(duì)照品(中日友好醫(yī)院自制,純度≥99%),乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher 公司);甲醇為分析純;水為高純水。

    山海螺供試品由中日友好醫(yī)院門診中藥房提供(購(gòu)自北京鶴延齡藥業(yè)發(fā)展有限公司,產(chǎn)地:河北,批號(hào):140941)

    2 方法與結(jié)果

    2.1 不同產(chǎn)地山海螺中黨參炔苷的含量測(cè)定

    2.1.1 色譜條件

    色 譜 柱:Agilent Eclipse plus C18 (4.6mm×100mm,3.5μm);流動(dòng)相:乙腈-水,梯度洗脫50min(以乙腈比例表示),0~30min(5%~35%),30~50min(35%~100%);流 速:1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量10μl。 色譜圖見圖1。

    2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

    精密稱取黨參炔苷對(duì)照品10.14mg,置于50ml 量瓶中,用甲醇溶解并定容,搖勻,即得。

    2.1.3 供試品溶液的制備

    稱取山海螺樣品粉末5g(河北,過(guò)六號(hào)篩),精密稱定,置于100ml 錐形瓶中,精密加入甲醇50ml,稱定質(zhì)量,超聲處理30min(頻率100kHz,溫度40℃),冷卻至室溫,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,離心,取上清液,水浴蒸干,加甲醇溶解,定容至25ml,經(jīng)0.45μm 微孔濾膜濾過(guò),即得。

    2.1.4 空白對(duì)照品溶液的制備

    精密移取甲醇50ml,置于100ml 三角瓶中,按供試品溶液的制備方法制成空白對(duì)照溶液。

    2.1.5 線性關(guān)系考查分別精密移取對(duì)照品溶液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl,注入液相色譜儀,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。 以質(zhì)量濃度(x,μg/ml)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到黨參炔苷的回歸方程為y=37.067x+20.901(r=0.9999)。 結(jié)果表明,黨參炔苷質(zhì)量濃度在10.1~202.0μg/ml 范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

    2.1.6 其它方法學(xué)考查

    圖1 HPLC 圖(1-黨參炔苷)

    表1 樣品產(chǎn)地、含量測(cè)定及HPLC 指紋圖譜相似度分析結(jié)果(n=3)

    表2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    表4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件,分別考查精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率,結(jié)果分別見表2 和表3。

    2.1.7 樣品含量測(cè)定

    分別稱取13 個(gè)不同產(chǎn)地的山海螺樣品5 g (過(guò)六號(hào)篩),精密稱定,按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算樣品中黨參炔苷的含量,結(jié)果見表1。

    2.2 不同產(chǎn)地山海螺HPLC 指紋圖譜

    2.2.1 色譜條件

    同山海螺含量測(cè)定“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件。

    2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

    同山海螺含量測(cè)定“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備。

    2.2.3 供試品溶液的制備

    同山海螺含量測(cè)定“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備。

    2.2.4 其他方法學(xué)考查

    取S5 號(hào)山海螺樣品,按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件,分別考查精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性,經(jīng)國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A 版)進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果見表4。由結(jié)果可知,精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。

    2.2.5 山海螺樣品測(cè)定

    取13 個(gè)產(chǎn)地山海螺樣品,分別按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按照“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄50mim 色譜圖。 根據(jù)樣品溶液HPLC 提供的相關(guān)參數(shù),確定山海螺共有峰為18 個(gè),見圖2。

    2.2.6 指紋圖譜相似度計(jì)算

    圖2 不同產(chǎn)地山海螺HPLC 指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜R

    將13 個(gè)樣品的色譜圖導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì) 《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A 版),設(shè)定樣品S5 為參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法計(jì)算,進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配,選取“時(shí)間窗寬度”為0.1min,進(jìn)行譜峰自動(dòng)匹配。 結(jié)果見圖2 和表1,由結(jié)果可知,13 個(gè)樣品的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.848~0.994 范圍內(nèi)。

    3 討論

    山海螺的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,黃昌杰[16]、王文永[17]采用HPLC 法測(cè)定了山海螺中紫丁香苷的含量,武佳等采用HPLC 法測(cè)定了四葉參中四葉參皂苷的含量[18],趙燕燕等采用HPLC 法測(cè)定了泰山四葉參的指紋圖譜[19],陳恒沖[20,21]用薄層色譜(TLC)法鑒別輪葉黨參藥材,以高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定藥材中輪葉黨參皂苷的含量;又采用高效液相色譜法測(cè)定了東北地產(chǎn)輪葉黨參的指紋圖譜。綜合分析,上述文獻(xiàn)中沒有以黨參炔苷作為質(zhì)控制指標(biāo)的,而且用于山海螺指紋圖譜研究的樣品產(chǎn)地也有限,因此,筆者將黨參炔苷作為山海螺的質(zhì)控指標(biāo),采用HPLC 法測(cè)定13個(gè)不同產(chǎn)地山海螺中黨參炔苷的含量及指紋圖譜,是很有意義的。該方法簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,可作為山海螺的質(zhì)量控制方法,為山海螺的質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)。 通過(guò)測(cè)定13 個(gè)不同產(chǎn)地山海螺中黨參炔苷的含量可知,不同產(chǎn)地的樣品差異較大,其中,安徽六安的含量最高,廣東茂名的含量最低,分析其原因,可能與產(chǎn)地、采收季節(jié)、生長(zhǎng)年限、是否野生有關(guān),但具體原因有待進(jìn)一步研究。

    供試品溶液的制備方法,本文考察了超聲法、回流法、煎煮法3 種提取方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn),超聲法與回流法、煎煮法提取效率無(wú)顯著差異,但超聲法操作簡(jiǎn)便,可控性強(qiáng),故選擇超聲提取法; 然后筆者對(duì)超聲提取時(shí)間(15、30、45min)進(jìn)行了考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),30min 和45min 提取效率無(wú)顯著性差異,均高于15min,,故選擇超聲提取時(shí)間30min;最后筆者簡(jiǎn)單地對(duì)提取溶劑(甲醇、水)進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效率遠(yuǎn)高于水,故選用甲醇為提取溶媒。

    檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇,筆者考察了210nm、254nm、280nm、320nm、380nm 共5 個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),210nm 時(shí)山海螺HPLC 色譜圖中各色譜峰面積較大且分離度良好,故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇210nm。

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