破骨細胞分化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶-2在外耳道膽脂瘤中的表達及意義

趙昱 彭軍 劉汝利

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 唐山 063000；2.河北省唐山市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 唐山 063000)

外耳道膽脂瘤(external auditory canal cholesteatoma, EACC)是由各種原因引起的外耳道鱗狀上皮增生形成的膠質(zhì)碎片聚集，內(nèi)含膽固醇結(jié)晶[1]。該病是一種邊界清楚的良性囊性病變，因具有類似于惡性腫瘤的侵襲特性，常導(dǎo)致周圍骨質(zhì)結(jié)構(gòu)不同程度的吸收、破壞。EACC早期病變局限在外耳道，隨著病情發(fā)展可侵及鼓膜，晚期可突破鼓膜侵及鼓室或乳突[2]。該病破壞力強，如不及時清除病變組織，可廣泛破壞骨質(zhì)，嚴重者可引起顱內(nèi)、外并發(fā)癥。對周圍骨質(zhì)的進行性溶骨性破壞是EACC最重要的病理生理學(xué)特征，其發(fā)生機制也一直受到眾多耳鼻喉科學(xué)者的重視。既往研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子參與的骨質(zhì)破壞以及酶類介導(dǎo)的骨質(zhì)吸收在EACC的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用，其中破骨細胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)與基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的表達越來越受到關(guān)注。本研究采用免疫組化方法檢測RANKL與MMP-2在EACC中的表達情況，觀察兩者表達水平與患者骨質(zhì)破壞程度的相互關(guān)系以及兩者之間的相關(guān)性，從而進一步探討EACC骨質(zhì)破壞的可能發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2015年6月～2018年5月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院和唐山人民醫(yī)院耳鼻咽喉科EACC患者手術(shù)標(biāo)本共47例為觀察組，男性29例、女性18例；年齡14～62歲,平均36.5歲；均為單側(cè)耳發(fā)病；病程3個月～16年。經(jīng)臨床及病理檢查證實為EACC。選取同期18例外耳道外傷(或者乳突根治術(shù)+外耳道成形術(shù))患者外耳道骨段正常皮膚為對照組。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前均行耳部?？茩z查、顳骨高分辨率CT檢查，所有標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)確診為EACC；②均為第1次接受治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有耳道其他病變，伴有其他慢性炎癥性疾病，或既往有耳部手術(shù)史的患者；②手術(shù)前接受過相關(guān)藥物治療的患者。根據(jù)臨床特點及顳骨高分辨CT檢查，Shin等[3]將EACC分為以下4型，以此來劃分骨質(zhì)破壞程度。Ⅰ型：膽脂瘤致外耳道局限性擴展，骨壁破壞，但病變僅局限在外耳道；Ⅱ型：膽脂瘤破壞范圍超出外耳道，侵犯至鼓膜以及中耳范圍；Ⅲ型：膽脂瘤不僅造成外耳道骨壁的缺損，而且累及乳突氣房；Ⅳ型：膽脂瘤病變超出顳骨范圍。本組病例中，Ⅰ型7例，外耳道骨壁局限性擴展，骨壁被破壞；Ⅱ型20例，4例單純侵及鼓膜，但鼓室內(nèi)未見骨質(zhì)破壞，16例同時侵及鼓膜及鼓室，未侵及鼓竇、乳突；Ⅲ型18例，單純經(jīng)外耳道后壁侵及乳突11例，同時侵及鼓室及乳突7例；Ⅳ型2例，分別侵及硬腦膜與顳頜關(guān)節(jié)。

1.2 方法 所有標(biāo)本于術(shù)中取出后立即浸泡于10%甲醛中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，作3～4 μm厚的連續(xù)切片。兔抗人RANKL 、MMP-2多克隆IgG抗體均購自北京博奧森生物有限公司，免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺顯色盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有抗體均為濃縮液，預(yù)先稀釋成不同濃度的工作液進行預(yù)實驗，以最理想的染色濃度(1∶400)用于正式實驗。所有切片均經(jīng)多聚賴氨酸及高溫、高壓預(yù)處理，按照免疫組化EnVision法常規(guī)程序進行染色。用已知陽性片做陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)顯色范圍和強度2個方面進行判斷，RANKL與MMP-2陽性信號均為細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。結(jié)果由2位病理科醫(yī)師進行雙盲法閱片綜合評出。MMP-2以每個視野下黃色及棕黃色顆粒細胞數(shù)占視野中所有細胞數(shù)的百分比作為陽性細胞率，每張切片隨機取5個400倍視野，觀察計數(shù)后取平均值，以陽性細胞率≤10%為陰性、>10%～25%為弱陽性、>25%～50%為陽性、>50%為強陽性[4]。RANKL以相同方法進行判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行χ2檢驗、確切概率法檢驗和相關(guān)性分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05,均以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組RANKL與MMP-2的表達與比較 免疫組化結(jié)果顯示，RANKL和MMP-2 主要表達于細胞質(zhì)。47例EACC標(biāo)本中，RANKL與MMP-2表達陽性率分別為 76.60%(36/47)和78.72%(37/47，圖1)；18例對照組標(biāo)本中，RANKL與MMP-2表達陽性率分別為11.11%(2/18)和16.67%(3/18，圖2)。兩者比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.983、21.177，P值均<0.05)。

圖1. MMP-2(A)、RANKL(B)分別在EACC中的陽性表達，細胞質(zhì)內(nèi)可見大量棕黃色或棕褐色顆粒分布(EnVision法×200)

圖2. MMP-2(A)、RANKL(B)分別在外耳道正常皮膚中的陽性表達，細胞質(zhì)內(nèi)無明顯或可見極個別的棕黃色顆粒，數(shù)量少，分布稀疏(EnVision法×400)

2.2 EACC中RANKL、MMP-2的表達與臨床病理特征以及骨質(zhì)破壞程度與病程的關(guān)系 觀察組中RANKL、MMP-2的陽性表達與EACC患者的性別、年齡、發(fā)病部位均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，與骨質(zhì)破壞程度有明顯相關(guān)性(P<0.05，表1)。骨質(zhì)破壞程度與病程有明顯相關(guān)性(P<0.05，表2)。

表1 EACC組中RANKL和MMP-2的表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表2 骨質(zhì)破壞程度與病程之間的關(guān)系[n(%)]

2.3 EACC組織中RANKL和MMP-2表達之間的關(guān)系 觀察組中，RANKL和MMP-2 同為陽性者33例，同為陰性者7例，兩者之間呈顯著相關(guān)性(γ=0.572，P=0.000；表3)。

表3 RANKL 、MMP-2在EACC組織中表達的相關(guān)性分析(n)

2.4 RANKL和MMP-2的表達對EACC的診斷價值 由表4可以看出，RANKL、MMP-2診斷EACC的ROC下面積分別為0.827、0.810，說明RANKL和MMP-2對EACC的診斷價值均較好。對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為76.6%、88.9%和78.7%、83.3%。結(jié)果見表4和圖3。

表4 RANKL、MMP-2診斷EACC的價值分析

圖3. RANKL 、MMP-2診斷EACC的ROC

3 討論

EACC是一種外耳道的慢性炎癥，其臨床特點為外耳道鱗狀上皮增生形成的膠質(zhì)碎片堆積，并對周圍組織產(chǎn)生破壞[5]。該病的發(fā)生機制是多因素相互作用的復(fù)雜過程,具有明顯的侵襲特性。對鄰近骨質(zhì)的侵襲及破壞是該病最重要的臨床特征，并且隨著病情的發(fā)展，膽脂瘤體積的增大，周圍骨壁結(jié)構(gòu)會被破壞得越加嚴重，其危害及預(yù)后主要取決于膽脂瘤對周圍骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的吸收、破壞程度。近些年有不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)在較小體積的EACC中同樣觀察到骨質(zhì)破壞，說明其骨質(zhì)破壞機制并非只是膨脹性的壓迫[2，6]。Jung等[7]研究發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤的骨質(zhì)破壞發(fā)生機制與破骨細胞的活化水平有密切關(guān)系，破骨細胞可能是膽脂瘤骨質(zhì)破壞機制中起最終作用的關(guān)鍵細胞。破骨細胞在體內(nèi)是一個具有高度專業(yè)化的骨吸收細胞，來源于造血干細胞的單核-巨噬細胞前體分支，可直接參與骨質(zhì)的降解，是生理狀態(tài)下骨組織吸收的主要功能細胞。目前更多學(xué)者認為，骨質(zhì)的吸收、破壞是由于在局部炎性環(huán)境刺激下產(chǎn)生的各種蛋白分解酶[8]及多種細胞因子，通過不同途徑調(diào)節(jié)破骨細胞的活性最終引發(fā)骨膜炎或骨質(zhì)溶解吸收。RANKL、MMP-2對破骨細胞有重要的調(diào)節(jié)功能，均可激活其活性，使之發(fā)揮降解骨質(zhì)的功能。

RANKL是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的成員，是誘導(dǎo)破骨細胞活化的關(guān)鍵細胞因子。RANKL與其配體核因子-κB受體活化因子(RANK)在巨噬細胞集落刺激因子存在的情況下結(jié)合，通過 RANKL-RANK-骨蛋白酶(osteoprotegerin, OPG )通路對破骨細胞的活化進行復(fù)雜的反饋調(diào)控，從而引發(fā)骨的降解、退化。而上述機制可被OPG抑制。OPG歸屬于TNF家族，是一種生長因子受體。OPG可直接與RANKL結(jié)合，阻斷RANKL/RANK之間的相互作用，抑制破骨細胞活化、成熟，從而減少骨質(zhì)吸收。OPG與RANKL在體內(nèi)骨組織中的相對表達水平對破骨細胞的活化或抑制具有決定性的作用?？梢姡琑ANKL/OPG比值好比一個杠桿，在體內(nèi)骨降解和骨形成的平衡關(guān)系中發(fā)揮著無可替代的作用。RANKL-RANK-OPG是人體內(nèi)骨質(zhì)吸收的共同通路，而RANKL作為破骨細胞分化和調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵因子，可直接影響破骨細胞的功能，是促進骨質(zhì)吸收的關(guān)鍵因素。本研究結(jié)果顯示，RANKL在EACC組織中的陽性表達率明顯高于對照組，并且RANKL的陽性表達隨著骨質(zhì)破壞程度的加重而增強，破骨細胞數(shù)量也明顯增多，因而推測RANKL參與了EACC的骨質(zhì)破壞過程，且其表達和分布與破骨細胞的形成密切相關(guān)。這與Hamzei等[9]的實驗結(jié)果相符。在膽脂瘤上皮層和上皮下組織中觀察到大量炎性細胞，如T淋巴細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等，并且高表達RANKL,而在對照組中并沒有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，提示炎癥反應(yīng)與細胞因子間的相互調(diào)控在膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用。這些炎性細胞通過高表達RANKL，從而激活破骨細胞，引發(fā)骨質(zhì)溶解吸收[10-11]。由本實驗可以認為，RANKL在EACC骨質(zhì)破壞機制中具有重要的生物學(xué)功能，進一步提示破骨細胞的分化、活化可能在EACC骨質(zhì)破壞機制中起重要作用。

MMPs是在結(jié)構(gòu)上具有很多共同生化性質(zhì)可降解細胞外基質(zhì)的一組內(nèi)肽酶的總稱，因含Zn2+和Ca2+而得名,在體內(nèi)由多種基質(zhì)細胞和炎癥細胞分泌,并且在組織重建與修復(fù)、炎癥反應(yīng)、腫瘤血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[12]。MMP-2是MMPs在體內(nèi)分布最廣的家族成員之一，屬于蛋白水解酶，在降解基底膜及細胞外基質(zhì)方面具有重要作用 ,是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，主要由成纖維細胞產(chǎn)生，分布在膽脂瘤上皮下結(jié)締組織中，是骨有機基質(zhì)降解的主要因素，可直接參與生理性和病理性溶骨機制。Chole[13]認為,膽脂瘤骨質(zhì)破壞的發(fā)生主要是由于破骨細胞的作用，MMPs在膽脂瘤中高表達，可以通過清除骨組織的骨樣表面，促進破骨細胞的活性，從而發(fā)生骨質(zhì)吸收、破壞。破骨細胞與成骨細胞在骨質(zhì)破壞過程中活性增強，分泌MMPs，并相互激活，降解骨基質(zhì)，從而成為膽脂瘤的侵襲力和破壞力[14]?？梢?，MMPs在EACC的骨質(zhì)破壞中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果顯示，MMP-2在EACC中的陽性表達顯著高于對照組，并且骨質(zhì)破壞程度越高MMP-2的陽性表達率越高，該實驗結(jié)果與周旭峰等[15]的結(jié)果相符。同時在膽脂瘤上皮及基質(zhì)周圍發(fā)現(xiàn)炎性細胞與MMP-2共同表達，且在骨質(zhì)破壞嚴重的標(biāo)本中兩者表達明顯增強，破骨細胞的數(shù)量也相應(yīng)增多?；谝陨习l(fā)現(xiàn)推測，EACC骨質(zhì)吸收可由炎癥細胞分泌MMP-2引起破骨細胞活化而引發(fā)。

本實驗結(jié)果顯示，EACC組織中RANKL與MMP-2表達明顯高于對照組，兩者表達水平呈正相關(guān)，且隨著兩者表達水平的提高，骨質(zhì)破壞程度也加重，從而分析兩者的表達水平與骨質(zhì)破壞程度具有相關(guān)性，推測兩者共同參與了EACC的骨質(zhì)破壞過程，并且在骨吸收方面可能具有協(xié)同作用。本實驗未觀察到兩者的表達與患者性別、年齡、發(fā)病部位等因素的相關(guān)性。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，患者的病程越長，骨質(zhì)破壞程度越嚴重；骨質(zhì)破壞程度與病程具有很大的相關(guān)性，說明病程在EACC骨質(zhì)破壞的發(fā)生、發(fā)展中是一個不可忽視的重要因素。根據(jù)ROC圖分析顯示，RANKL、MMP-2在EACC中的高表達對于診斷該病有著較高的靈敏度與特異度。

EACC和中耳膽脂瘤雖然在發(fā)病部位與侵襲方向以及發(fā)病機制方面不同，但在病理組織學(xué)上的表達無明顯差異。根據(jù)許多學(xué)者的研究結(jié)果[15-19]以及本實驗結(jié)果進行聯(lián)合分析，RANKL、MMP-2在EACC與中耳膽脂瘤中陽性率的表達無明顯差異，均為高表達，并與骨質(zhì)破壞密切相關(guān)。因而，該實驗結(jié)果對于臨床診療膽脂瘤也許可以提供一個新的理論依據(jù)，并可能為有效治療膽脂瘤提供有效線索。

綜上所述，EACC組織中RANKL、MMP-2表達上調(diào)，可能在EACC骨質(zhì)破壞過程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能，是該病病情進展的一個潛在危險因素。兩者以直接或間接的方式激活破骨細胞并上調(diào)其活性，從而加速骨細胞凋亡和骨基質(zhì)降解，促進骨吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞。將兩者作為生物學(xué)標(biāo)志物進行聯(lián)合檢測，不僅有利于對EACC患者病變程度及預(yù)后進行評估，還對該病有著較高的診斷價值。