不同因素對IVF實(shí)驗(yàn)室試劑潛在胚胎毒性的影響

邱楓 饒金鵬

【摘要】 目的：探討體外受精（IVF）胚胎培養(yǎng)液分裝與否及開封時間長短對質(zhì)量的影響，以降低因試劑不合理使用導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室不良情況發(fā)生，進(jìn)而降低不良妊娠結(jié)局發(fā)生率。方法：分別將待檢測的卵泡沖洗液、配子處理液、受精液、卵裂液、囊胚培養(yǎng)液取出1/2體積在無菌條件下分裝;余下1/2未分裝試劑同分裝試劑均于-4 ℃保存0、14、28 d。在0、14、28 d時，以質(zhì)控合格的精子沖洗培養(yǎng)液為對照，分裝及未分裝試劑加或不加血清平衡過夜后進(jìn)行精子存活試驗(yàn)（human sperm motility assay，HSMA），72 h后計算并比較精子存活指數(shù)。結(jié)果：分裝及未分裝試劑精子存活指數(shù)均>0.85。分裝及未分裝試劑在同一時間點(diǎn)檢測，受精液精子存活指數(shù)均為最高，卵裂液精子存活指數(shù)均為最低。同一時間點(diǎn)檢測，分裝試劑精子存活指數(shù)均高于未分裝，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。試劑在分裝及未分裝條件下檢測，0 d精子存活指數(shù)高于14、28 d，14 d精子存活指數(shù)高于28 d，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：分裝及未分裝試劑在開封后28 d內(nèi)，雖均未表現(xiàn)出明顯的胚胎毒性，但精子存活指數(shù)隨放置時間增加均有下降趨勢。因此，試劑開封后28 d內(nèi)應(yīng)盡量縮短儲存時間。在相同時間點(diǎn)，分裝與否對潛在胚胎毒性均無明顯影響，但分裝可能會減少試劑的污染。因此，試劑未能一次性使用完畢應(yīng)進(jìn)行分裝。

【關(guān)鍵詞】 IVF實(shí)驗(yàn)室試劑 胚胎毒性 精子存活試驗(yàn) 分裝 開封時間

[Abstract] Objective： To investigate the effect of packaging and the opening time of IVF embryo culture solution on the quality， so as to reduce the occurrence of adverse laboratory conditions caused by irrational use of reagents， and then to reduce incidence of adverse pregnancy outcomes. Method： ASP， G-MOPS， G-IVF， G-1， G-2 to be tested were separately taken out of 1/2 volume and packed under sterile condition. The remaining 1/2 non-packed reagents and packed reagents were stored at -4 ℃ for 0， 14 and 28 days. At 0， 14 and 28 days， qualified HTF as the contrast， and the sperm motility assay was carried out through the packed reagents and non-packed reagents combined with serum balance after overnight. Sperm motility indexes were calculated and compared after 72 h. Result： The sperm motility indexes of packed and non-packed reagents were greater than 0.85. Packed reagents and non-packed reagents were tested at the same time， sperm motility indexes of G-IVF were the highest， and sperm motility indexes of G-1 were the lowest. At the same time， sperm motility indexes of packed reagents were higher than those of non-packed reagents， but the differences were not statistically significant （P>0.05）. The reagents were tested under the conditions of packed and non-packed， the sperm motility indexes at 0 d were higher than 14 and 28 d， and the sperm motility indexes at 14 d were higher than 28 d， but the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Although no significant embryotoxicity was observed in packed reagents and non-packed reagents within 28 days after opening， the sperm motility indexes tended to decrease with the increase of storage time， so the use time of reagents should be shortened as much as possible within 28 days after opening. At the same time， there was no significant effect on potential embryotoxicity between packed and non-packed. However， packed may reduce the contamination of reagents. Therefore， reagents should be packed if they can not be used at one time.

嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制與質(zhì)量保障系統(tǒng)是配子和胚胎生長發(fā)育的必要條件，對維持IVF成功率具有重要作用[1-2]。在體外受精過程中，配子及胚胎對培養(yǎng)環(huán)境要求很高，培養(yǎng)液作為與配子及胚胎直接接觸的微環(huán)境，其成分、pH值、滲透壓及內(nèi)毒素任何一項(xiàng)發(fā)生改變都可能影響配子及胚胎的正常發(fā)育，直接影響IVF妊娠率，甚至導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的出現(xiàn)。因此，培養(yǎng)液對配子及胚胎體外培養(yǎng)至關(guān)重要。人精子存活試驗(yàn)（human sperm motility assay，HSMA）建立于20世紀(jì)80年代，可通過觀察精子活力變化檢測培養(yǎng)液是否存在胚胎毒性，尤其對低含量的毒性非常敏感，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床工作中質(zhì)控新入庫試劑及耗材[3]。對于新建IVF實(shí)驗(yàn)室，IVF周期數(shù)較少，培養(yǎng)液使用量小，導(dǎo)致試劑儲存時間延長，存在有效期內(nèi)試劑過?，F(xiàn)象。在實(shí)驗(yàn)室冰箱2 ℃～8 ℃儲存條件下，試劑是否分裝及開封時間長短對試劑胚胎毒性的影響尚缺乏考證。為了使試劑得到合理使用，減少浪費(fèi)的同時避免因儲存時間過久、打開次數(shù)過多導(dǎo)致配子及胚胎異常發(fā)育，本研究通過HSMA比較IVF實(shí)驗(yàn)室試劑分裝與否及開封時間長短對試劑潛在胚胎毒性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 36份精液標(biāo)本均來自2019年1-7月于筆者所在醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心門診就診的健康生育男性，年齡20～35歲;否認(rèn)酗酒、嗜煙、吸食大麻等不良嗜好;精液體積、精子濃度、總數(shù)、活動率等參數(shù)均正常（具體標(biāo)準(zhǔn)參照世界衛(wèi)生組織精液分析第五版[4]）。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 精子密度梯度液（美國SAGE Pure Ception 40%，80%）、精子洗滌液（mHTF）、卵泡沖洗液（ASP）、配子處理液（G-MOPS）、受精液（G-IVF）、卵裂液（G-1）、囊胚培養(yǎng)液（G-2），均購自瑞典vitrolife公司。G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2使用前按要求加入10%血清，除G-MOPS于前1 d配置，置于37 ℃培養(yǎng)箱外，其余培養(yǎng)液均于前1 d配置，置于37 ℃、6% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將待檢測的ASP、G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2取1/2體積在無菌條件下分裝，余下1/2未進(jìn)行分裝。以質(zhì)控合格的mHTF為對照。

1.1.3 耗材與設(shè)備 標(biāo)準(zhǔn)垂直凈化工作站（蘇州智凈 SW-CJ-1FD）、高速離心機(jī)（美國 THERMO SL16R）、相差顯微鏡（日本 OLYMPUS CX31）、恒溫培養(yǎng)箱（美國 THERMO3111）、Markler計數(shù)板（以色列 SELF-MEDICAL）、彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)（北京偉力 WLJY-9000）、移液槍（eppendorf）;無菌取精杯、15 ml離心管、3 ml圓底試管、無菌移液管（美國BD Falcon公司）。

1.2 方法

1.2.1 精子存活試驗(yàn) 待精液完全液化后，用精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)檢測精子各項(xiàng)參數(shù)。取15 ml離心管，將1 ml 80%的密度梯度液加入離心管底部，1 ml 40%的密度梯度液緩慢沿管壁加在80%的密度梯度液上層，兩液間有一清晰分層。平衡至室溫后，將精液緩慢沿管壁加在40%的密度梯度液液面上，以400 r/min離心20 min后去除上層精液及密度梯度混懸液（puresperm混懸液），加入5 ml已質(zhì)控合格的mHTF，吹打混勻后以200 r/min離心5 min，丟棄上清液，重復(fù)洗滌兩次。沿管壁緩慢加入0.5 ml mHTF上游，30～40 min后，取出上層精子懸浮液，用Markler計數(shù)板計數(shù)后加入mHTF及待檢測培養(yǎng)液中，調(diào)精子終密度為5×106/ml。根據(jù)試劑要求置于通或不通37 ℃、6% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24小時混勻精子做精液分析，72 h后計算并比較精子存活指數(shù)。若精子存活指數(shù)>0.85說明試驗(yàn)合格，否則表明該培養(yǎng)系統(tǒng)存在潛在胚胎毒性[5]。

1.2.2 分裝培養(yǎng)液 分別將待檢測ASP、G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2取出1/2體積在無菌條件下分裝到質(zhì)控合格的3 ml圓底試管，標(biāo)記分裝試劑名稱、分裝時間及體積，并用封口膜封閉;余下1/2未分裝試劑同分裝試劑均于-4 ℃保存0、14、28 d，標(biāo)記開封時間后用封口膜封閉。

1.3 觀察指標(biāo)

在0、14、28 d時，以質(zhì)控合格的mHTF為對照，以上5種分裝及未分裝試劑加或不加血清平衡過夜后進(jìn)行HSMA，于72 h后在顯微鏡下計算質(zhì)控合格的mHTF、5種分裝及未分裝試劑精子存活率，計算并比較精子存活指數(shù)。精子存活指數(shù)=5種分裝及未分裝試劑精子存活率/質(zhì)控合格的mHTF精子存活率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

5種分裝及未分裝試劑精子存活指數(shù)均>0.85，均合格。分裝及未分裝試劑在同一時間點(diǎn)檢測，G-IVF精子存活指數(shù)均為最高，G-1精子存活指數(shù)均為最低。同一時間點(diǎn)檢測，分裝試劑精子存活指數(shù)均高于未分裝試劑，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。試劑在分裝及未分裝條件下檢測，0 d精子存活指數(shù)高于14、28 d，14 d精子存活指數(shù)高于28 d，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

3 討論

人類輔助生殖技術(shù)包括體外受精、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植等過程，這些過程均離不開胚胎培養(yǎng)液，質(zhì)量穩(wěn)定可靠的培養(yǎng)液直接關(guān)系到輔助生殖技術(shù)的每個過程，從而最終影響試管嬰兒妊娠率。目前使用的培養(yǎng)液都含有相對不穩(wěn)定的成分，比如氨基酸和維生素等[3]。雖然IVF商品化試劑出廠前經(jīng)過嚴(yán)格試劑質(zhì)控，運(yùn)輸過程亦使用標(biāo)準(zhǔn)冷鏈系統(tǒng)，但不同培養(yǎng)液、不同批號的同種培養(yǎng)液的質(zhì)量都是有差別的。另外，季節(jié)性及供應(yīng)途中保護(hù)措施不當(dāng)均會影響培養(yǎng)液質(zhì)量[6]。為確保試劑質(zhì)量，試劑入庫前仍需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格質(zhì)控[7-8]。常用的質(zhì)控方法有化學(xué)質(zhì)控和生物學(xué)質(zhì)控，化學(xué)質(zhì)控有pH檢測、滲透壓測定、內(nèi)毒素測定;生物學(xué)質(zhì)控方法有精子存活試驗(yàn)、人類卵母細(xì)胞/胚胎培養(yǎng)法、小鼠胚胎生物檢測、體細(xì)胞增殖試驗(yàn)[9-10]。人精子存活試驗(yàn)取材方便經(jīng)濟(jì)，對低含量的毒性成分十分敏感，常被應(yīng)用于測定試劑質(zhì)量和毒性工作中[9]。同時，人精子存活試驗(yàn)?zāi)茴A(yù)測卵細(xì)胞的質(zhì)量和受精結(jié)局，是一種價值較高的質(zhì)控方法[11]。本研究通過人精子存活試驗(yàn)對不同因素影響的IVF培養(yǎng)液進(jìn)行檢測質(zhì)控，結(jié)果顯示，本批次的培養(yǎng)液均質(zhì)控合格。

IVF培養(yǎng)液的運(yùn)輸和儲存均能影響其穩(wěn)定性。IVF實(shí)驗(yàn)室對于培養(yǎng)液的存放一般要求不改變培養(yǎng)液的性質(zhì)，將細(xì)菌污染風(fēng)險降到最低。一般情況下，微生物在10 ℃以下發(fā)育可被顯著抑制，故培養(yǎng)液一般儲存于2 ℃～8 ℃環(huán)境中，并且在使用時盡量縮短培養(yǎng)液暴露于室溫下的時間[12]。對于新建IVF實(shí)驗(yàn)室，由于周期數(shù)少，試劑開封后可能會多次使用，隨著試劑使用頻率的增加，培養(yǎng)液在室溫下暴露的時間隨之增加。如果對培養(yǎng)液進(jìn)行分裝可減少其在室溫下暴露時間，并減少開封次數(shù)，但也會增加IVF成本。本研究通過比較分裝與未分裝狀態(tài)下培養(yǎng)液在28 d內(nèi)的質(zhì)量，結(jié)果顯示，分裝與未分裝狀態(tài)下，在0、14、28 d時培養(yǎng)液均質(zhì)控合格，且在同一時間點(diǎn)，分裝試劑精子存活指數(shù)與未分裝試劑精子存活指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明在28 d內(nèi)分裝與未分裝試劑對培養(yǎng)液質(zhì)量并無顯著影響。因此，各實(shí)驗(yàn)室可按需求來決定分裝與不分裝試劑。但從細(xì)菌學(xué)角度來講，分裝試劑可在一定程度上減少試劑污染，建議新建IVF實(shí)驗(yàn)室對試劑進(jìn)行分裝，同時也可減少試劑浪費(fèi)。

目前，商品化試劑均為含有氨基酸等各種成分的培養(yǎng)液，每種成分的儲存條件各不相同，如培養(yǎng)液中含有的青霉素、鏈霉素在水溶液中十分不穩(wěn)定，隨著時間的延長，成分分解越多[5]。因此，儲存試劑不可能使每種成分達(dá)到最佳儲存狀態(tài)，相對不穩(wěn)定的成分會在一定時間內(nèi)較早失去其應(yīng)有的性能。每種試劑都有相應(yīng)保質(zhì)期，但開封后分裝與未分裝試劑在儲存一定時間后是否質(zhì)控合格尚未得知。本試驗(yàn)通過比較開封后保存0、14、28 d相應(yīng)試劑的精子存活指數(shù)，結(jié)果顯示，28 d內(nèi)各種試劑的精子存活指數(shù)均在0.85以上，不同時間點(diǎn)精子存活指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明在28 d內(nèi)培養(yǎng)液質(zhì)量未受到明顯影響。但無論哪種試劑，隨著時間的延長，精子存活指數(shù)均呈下降趨勢，即培養(yǎng)液的質(zhì)量呈下降趨勢。保存28 d仍在質(zhì)控范圍內(nèi)，故試劑開封后應(yīng)盡快使用，根據(jù)每個實(shí)驗(yàn)室周期數(shù)量及儲存條件不同，選擇合適的丟棄時間，以防影響實(shí)際應(yīng)有的性能。本試驗(yàn)尚存在一些不足，如未能檢測儲存更長時間的培養(yǎng)液質(zhì)量。后期可在已有數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上根據(jù)本試驗(yàn)的條件探究儲存更長時間的培養(yǎng)液質(zhì)控如何，減少試劑浪費(fèi)的同時降低胚胎毒性。

參考文獻(xiàn)

[1]黃國寧，劉東云，韓偉.輔助生殖技術(shù)實(shí)驗(yàn)的建設(shè)及其質(zhì)量控制[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2010，26（10）：755-758.

[2] Saghooni N M，Amirian M，Sadeghi R，et al.Effectiveness of infertility counseling on pregnancy rate in infertile patients undergoing assisted reproductive technologies：a systematic review and meta-analysis[J].International Journal of Reproductive BioMedicine，2017，15（7）：391-402.

[3]黃國寧.輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：131-133.

[4]世界衛(wèi)生組織.世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊[M].第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：10-35.

[5]黃國寧，孫海翔.體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室技術(shù)[M].第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：35，228.

[6]趙濟(jì)華，曹云霞，周平，等.人精子存活試驗(yàn)對輔助生殖技術(shù)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的評價[J].中國婦幼保健雜志，2005，20（14）：1714-1716.

[7] Matson P L.Internal quality control and external quality assurance in IVF laboratory[J].Human Reproduction，1998，13（Suppl 4）：156-165.

[8] Gianaroli L.ESHRE guidelines for good practice in IVF laboratories[J].Human Reproduction，2000，15（10）：2241-2245.

[9] Claassens O E，Wehr J B，Harrison K L.Optimizing sensitivity of the human sperm motility assay for embryo toxicity testing[J].Human Reproduction，2000，15（7）：1586.

[10] Critchlow J D，Matson P L，Newman M C，et al.Quality control in an invitro fertilization laboratory use of human sperm survival studies[J].Human Reproduction，1989，4（5）：545-550.

[11] Hossain A M，Rizk B，et al.Human sperm bioassay has potential in evaluating the quality of cumulus-oocyte complexes[J].Archives of Andrology，1996，37（1）：7.

[12]孫丹丹，盧士玲，李開雄，等.貯藏溫度對冷鮮羊肉微生物菌群生長變化的影響[J].食品工業(yè)科技，2017，4（38）：327-331.

（收稿日期：2019-10-10） （本文編輯：李盈）