解脲脲原體感染對精子血管內(nèi)皮生長因子及其受體表達(dá)和精子頂體酶的影響

馬曉萍 岳應(yīng)權(quán) 高曉勤

遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校組織胚胎學(xué)教研室（貴州遵義563006）

解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，Uu）是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞微生物，是人類泌尿生殖道感染的常見病原體，可感染睪丸、生殖管道及附屬性腺中，引起精子形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而導(dǎo)致男性不育［1］。研究報(bào)道，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體 2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）廣泛表達(dá)于人的睪丸、附睪、精囊和前列腺組織，且VEGF蛋白在精液中也有高表達(dá)［2］。VEGF及其VEGFR2的特異性表達(dá)對精子的發(fā)生發(fā)育以及最終成熟都有重要影響，并對精子的受精能力也起重要作用［3］。在受精過程，精子頂體酶（acrosin）是關(guān)鍵酶之一［4］，對于精子頂體酶活性的檢測對評(píng)估精液質(zhì)量以及精子受精能力都有非常重要的臨床意義［5］。本研究為探討Uu感染對精子VEGF和VEGFR2的表達(dá)量和精子頂體內(nèi)acrosin活性的影響，以闡明Uu感染引起男性不育的機(jī)制，為臨床診斷Uu感染的男性不育以及藥物治療效果的評(píng)估提供有效的檢測指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑美國Pharmacia公司的Percoll分離液；美國Abcam公司的VEGF、VEGFR2抗體（兔抗人多克隆）；北京中山金橋生物技術(shù)有限公司的山羊抗小鼠IgG（Alexa Fluor?594標(biāo)記）；美國Abcam公司的DAPI染色液；珠海迪爾公司的Uu培養(yǎng)鑒定試劑盒；美國Toscience公司的精子細(xì)胞BWW培養(yǎng)液；武漢博士德生物有限公司的RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒；AmershamBioscience公司的PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑。

1.2 標(biāo)本來源研究對象均來自貴州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診男性不育癥患者，就診時(shí)間為2015年5月至2016年10月。正常生育組（30例）：年齡22～40歲，均有生育史，按照WHO規(guī)定的精液標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液常規(guī)各項(xiàng)檢查，檢查結(jié)果均符合正常精液標(biāo)準(zhǔn)。不育組（145例）：年齡23～42歲，婚后1年以上不育且已排除女方不孕因素，無性功能障礙病史、遺傳性疾病家族史及外傷史，生殖系統(tǒng)無器質(zhì)性病變，精漿及血清抗精子抗體陰性，精液細(xì)菌培養(yǎng)陰性，血清衣原體抗體陰性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者知情同意。

1.3 精液采集與分析無菌采集精液，待完全液化后，進(jìn)行精液常規(guī)檢查（輔助精子分析儀型號(hào)：CASASQH-Ⅲ型），檢測分析精液常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)（精子濃度、精子活力、精子形態(tài)等）。嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行，對精液進(jìn)行Uu培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn)。

1.4 Westernblot檢測精子VEGF蛋白表達(dá) 精液標(biāo)本采用密度梯度法離心分離出成熟精子。收集精子并懸浮洗滌2次，調(diào)整精子濃度。分別采用RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒，進(jìn)行細(xì)胞蛋白提取和蛋白濃度測定。提取50 μg蛋白經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)PVDF膜、TBS封閉后，滴加兔抗人多克隆VEGF抗體（1∶500稀釋）振蕩過夜；再滴加1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，經(jīng)洗膜、顯影，成像掃描。用目標(biāo)蛋白積分吸光度與內(nèi)參蛋白吸光度的比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.5 免疫熒光檢測精子VEGFR2蛋白表達(dá)精子涂片后室溫干燥，涂片分別滴加3%H2O2和1%Triton X-100孵育再用山羊血清封閉60 min。加入1∶400稀釋的兔抗人多克隆VEGFR2抗體過夜。洗滌后加入1∶100稀釋的山羊抗兔IgG（Alexa Fluor?594標(biāo)記）室溫孵育。DAPI染色后封片。分別隨機(jī)選取多個(gè)視野攝片用激光共聚焦顯微鏡觀察并照相，每組觀察200個(gè)精子計(jì)數(shù)精子VEGFR2標(biāo)記陽性率。

1.6 改良明膠底物膜法檢測arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）在改良明膠底物膜片滴加精子懸浮液50 μL于恒溫恒濕箱孵育（37℃，3 h），在Leica DME光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取數(shù)個(gè)視野對每張孵育片進(jìn)行觀察，每個(gè)視野觀察200個(gè)精子。arcosin反應(yīng)陽性為精子頭部出現(xiàn)明顯亮環(huán)并計(jì)數(shù)arcosin陽性反應(yīng)率。arcosin活性強(qiáng)度為每個(gè)精子頭部亮環(huán)直徑平均值，采用圖像分析系統(tǒng)中測微尺測量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和ANOVA單因素方差分析檢驗(yàn)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的精液常規(guī)檢測結(jié)果145例不育組中，精液Uu培養(yǎng)結(jié)果陽性47例，陽性率32.41%（47/145）。Uu陽性不育組與Uu陰性不育組精液分析結(jié)果（表1）。Uu陽性不育組的精子密度、精子活動(dòng)率和精子正常形態(tài)率均明顯低于正常生育組和Uu陰性不育組（P＜0.05）。

2.2 Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的精子VEGF蛋白的表達(dá)Western blot顯示正常生育組和不育各組精子多數(shù)存在VEGF蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示與正常生育組比較，Uu陽性不育組的精子VEGF/GAPDH平均光密度均明顯低于Uu陰性不育組和正常生育組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

表1 Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的精子密度、精子活動(dòng)率和精子正常形態(tài)率Tab.1 Sperm concentration，spermmotility and normal morphology rate of sperm in infertile group with negative and positive culture for Uu x±s

表1 Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的精子密度、精子活動(dòng)率和精子正常形態(tài)率Tab.1 Sperm concentration，spermmotility and normal morphology rate of sperm in infertile group with negative and positive culture for Uu x±s

注：與正常生育組比較，*P＜0.05

組別正常生育組Uu陰性不育組Uu陽性不育組例數(shù)30 98 47 Uu培養(yǎng)陽性率［例（%）］0（0.00）0（0.00）47（32.41）精子密度（×106/mL）101.30±14.15 82.78±12.29*64.32±10.15*精子活動(dòng)率（%）67.23±6.92 42.49±6.29*32.12±4.94*精子正常形態(tài)率（%）39.76±7.45 23.68±5.75*14.18±4.02*

2.3 免疫熒光檢測正常生育組和不育各組的精子VEGFR2蛋白正常生育組多數(shù)精子VEGFR2熒光表達(dá)均勻而明亮；Uu陰性不育組中部分精子VEGFR2熒光表達(dá)減弱；Uu陽性不育組中多數(shù)精子頂體處VEGFR2表達(dá)不均勻，精子熒光強(qiáng)度減弱，精子熒光陰性增多（圖2）。Uu陽性不育組的精子VEGFR2陽性率明顯低于Uu陰性不育組和正常生育組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 改良明膠底物膜法檢測arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）Uu陽性不育組的arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）明顯低于Uu陰性不育組和正常生育組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖1 Western blot檢測VEGF蛋白在精子的表達(dá)Fig.1 Detection of VEGF protein expression by Western blot

圖2 免疫熒光檢測精子VEGFR2蛋白的定位Fig.2 The localization of VEGFR2 on human spermatozoa by indirect immunofluorescent

圖3 改良明膠底物膜法檢測arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）（光鏡×400）Fig.3 The acrosin activity（acrosin-positive rate，acrosin-activity intensity）were examined by improved fixed-substrate film method.（LM ×400）

2.5 精子VEGF蛋白表達(dá)量、精子VEGFR2陽性率與arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）的相關(guān)性相關(guān)性分析提示精子VEGF蛋白表達(dá)量與arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.458、0.306，P＜0.01）；精子VEGFR2陽性率與arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.748、0.576、P＜ 0.01）。

3 討論

男性生殖道感染是引起男性不育的一個(gè)重要病因，Uu是引起男性泌尿生殖道感染的常見病原體，常寄居于泌尿生殖道，引起非淋菌性尿道炎、慢性前列腺炎、附睪炎等，導(dǎo)致男性不育［6］。精子在附睪內(nèi)達(dá)到功能成熟從而獲得受精能力，并依賴附睪合成和分泌的蛋白產(chǎn)生作用［7］。VEGF及其VEGFR2在人附睪組織中表達(dá)且與雄性生殖有關(guān)［8-9］。研究證實(shí)VEGF及其VEGFR2在附睪特異性表達(dá)不僅參與構(gòu)建精子附睪內(nèi)成熟的微環(huán)境，共同調(diào)節(jié)附睪微循環(huán)，還與精子在附睪中的成熟密切相關(guān)［10］。目前對Uu感染是否會(huì)影響精子VEGF及其VEGFR2表達(dá)尚未見相關(guān)報(bào)道，對于精子VEGF蛋白表達(dá)和VEGFR2陽性率是否與受精關(guān)鍵酶arcosin活性存在相關(guān)性，也未可知。因此，本研究通過檢測精子VEGF及其VEGFR2表達(dá)和精子arcosin活性，探討Uu感染對男性不育的影響的主要功能指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Uu陽性不育組的精子VEGF蛋白表達(dá)量明顯低于正常生育組和Uu陰性不育組，并采用免疫熒光明確VEGFR2清晰表達(dá)于人精子頂體，正常生育組多數(shù)精子頂體VEGFR2熒光表達(dá)強(qiáng)且陽性率較高，而精子VEGFR2表達(dá)在Uu陽性不育組的熒光表達(dá)和陽性率明顯減弱。研究已表明，Uu感染時(shí)，會(huì)廣泛引起睪丸病理損傷并影響生殖功能［11］，還可導(dǎo)致白細(xì)胞增加并產(chǎn)生活性氧和細(xì)胞因子損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)［12］。而VEGF與精子頂體形成密切相關(guān)，精子細(xì)胞頂體發(fā)育的全過程都有VEGF參與，VEGF表達(dá)可能在頂體發(fā)育中起重要作用［13］。因此，筆者推測Uu感染可能會(huì)引起附睪功能紊亂，而附睪功能紊亂會(huì)造成精子VEGF蛋白表達(dá)量減少及其VEGFR2陽性率下降，導(dǎo)致精子成熟障礙從而引起不育患者生育能力低下。研究表明VEGFR2在精子頂體有較高表達(dá)［14］。本研究也證實(shí)人精子頂體存在VEGFR2蛋白表達(dá)，說明在精子頂體的功能成熟過程中，精子VEGF表達(dá)并與精子VEGFR2特異的結(jié)合可能起著重要作用。

Uu感染造成生殖系統(tǒng)中吞噬細(xì)胞增多，產(chǎn)生氧自由基并與細(xì)胞膜上發(fā)生過氧化反應(yīng)，生成的過氧化產(chǎn)物可分解精子膜上的脂類，破壞精子膜的完整性［14］。而精子頂體膜結(jié)構(gòu)的不完整將會(huì)造成頂體內(nèi)膜上的頂體酶釋放障礙［15］，使精子發(fā)生頂體反應(yīng)障礙，阻礙精子穿透卵子透明帶導(dǎo)致受精失?。?6］。

本研究結(jié)果顯示Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）明顯低于正常生育組，且Uu陽性不育組的arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）為3組中最低，充分說明Uu感染會(huì)引起精子頂體處膜結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致頂體內(nèi)容物（包括arcosin）的流失，使精子與透明帶結(jié)合能力下降從而造成男性生育力的低下。

本研究首次證實(shí)精子VEGF蛋白表達(dá)量、VEGFR2陽性率分別與精子arcosin活性（arcosin陽性反應(yīng)率、arcosin活性強(qiáng)度）呈正相關(guān)。Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的精子VEGF蛋白表達(dá)減少和VEGFR2陽性率的降低都與精子頂體酶活性減弱密切相關(guān)。結(jié)果說明精子功能成熟的頂體完整率和頂體酶活性都較高，而Uu感染導(dǎo)致精子VEGF蛋白表達(dá)量及VEGFR2陽性率下降，同時(shí)會(huì)影響精子頂體成熟并引起精子頂體酶活性降低，而這些因素均可能使精子與透明帶結(jié)合障礙導(dǎo)致男性生育能力低下。

綜上所述，Uu感染可以引起附睪功能紊亂導(dǎo)致精子VEGF蛋白表達(dá)量及VEGFR2陽性率下降，還可以通過破壞精子膜完整性，引起精子頂體酶活性低下，從而使精子受精能力的下降導(dǎo)致男性不育，這也可能是Uu感染造成男性不育的重要原因之一。檢測精子VEGF蛋白及VEGFR2的表達(dá)和頂體酶活性為男性不育癥的診斷和藥物治療提供重要的基礎(chǔ)理論依據(jù)。