β-羥丁酸對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增生糖酵解的影響

于春娜 江 波 李文斌* 陳 峰

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)腫瘤綜合治療科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院胃腸外科/臨床營(yíng)養(yǎng)科，北京 100038)

腦膠質(zhì)瘤是一種起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，其惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，患者生存期短。目前，腦膠質(zhì)瘤標(biāo)準(zhǔn)治療包括最大限度的手術(shù)切除，繼而輔以放射治療及替莫唑胺化學(xué)藥物治療。但由于腫瘤組織的浸潤(rùn)特性，無(wú)法完全切除，殘存的腫瘤細(xì)胞常常成為復(fù)發(fā)的來(lái)源[1]。盡管在接受了全面地治療后，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)患者的平均生存期也僅有12～15個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)治療雖然在短期內(nèi)控制了膠質(zhì)瘤地生長(zhǎng)，但卻可以促進(jìn)并加快腫瘤的復(fù)發(fā)[2]。因此，尋找新的治療方法迫在眉睫。

能量代謝改變是腫瘤細(xì)胞的特征之一，即表現(xiàn)為無(wú)論在有氧或無(wú)氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞均以葡萄糖酵解作為能量供應(yīng)方式，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為“沃伯格”效應(yīng)[3]。因此，理論上可以通過(guò)限制葡萄糖攝入，選擇性饑餓腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到限制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。生酮飲食(ketogenic diet，KD)是一種高脂肪(60%～90%)、低碳水化合物(2%～5%)及適量蛋白質(zhì)的飲食方式，已在治療兒童難治性癲癇領(lǐng)域應(yīng)用了數(shù)十年[4]。KD提供的脂肪和蛋白質(zhì)可以滿(mǎn)足人體正常組織的基本能量代謝需求，但卻降低了體內(nèi)血糖濃度，減少了腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。不僅如此，KD還能發(fā)揮抗氧化、抑制炎性反應(yīng)及增強(qiáng)免疫的作用[5-6]。早在1995年，Nebeling等[7]就嘗試將KD應(yīng)用于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療，并取得一定治療效果。2010年，Zuccoli等[8]報(bào)道了1例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者經(jīng)過(guò)生酮飲食聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)療法治療后，腫瘤病灶消失，停止生酮飲食10周后腫瘤復(fù)發(fā)。之后的研究[9]顯示，KD可以延長(zhǎng)腦膠質(zhì)瘤患者生存期、改善預(yù)后并提高放射治療及化學(xué)藥物治療敏感性。

KD的核心是高脂肪及低碳水化合物，脂肪通過(guò)肝臟進(jìn)行β-氧化，生成β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate，β-HB)、乙酰乙酸(acetoacetate)以及丙酮(acetone)3種酮體，其中β-HB約占酮體總量的70%[10]。酮體作為除葡萄糖外的另一種供能物質(zhì)，被運(yùn)輸?shù)礁闻K之外的組織中產(chǎn)能。除了減少腫瘤的能量來(lái)源，KD的抗腫瘤作用部分歸功于產(chǎn)生的酮體。使用生理劑量的β-HB可以抑制人和鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增生[11]。此外，β-HB增加了放射治療和化學(xué)藥物治療藥物對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的治療效果[11-12]。雖然KD在荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7-12]中被證明有不錯(cuò)治療效果，但對(duì)β-HB的研究多集中于其抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞代謝影響的報(bào)道較少。因此，基于腫瘤細(xì)胞的“沃伯格”效應(yīng)，在本研究中探討了KD代謝產(chǎn)物β-HB對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及糖酵解的影響，進(jìn)一步闡釋KD抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

實(shí)驗(yàn)使用的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87及LN229由西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agilent公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Toyobo公司；Power SYBR?Green PCR Master MIX 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；兔抗人c-myc多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

U87及LN229細(xì)胞均用含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期胰蛋白酶消化傳代，置于5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用CCK8試劑檢測(cè)細(xì)胞增生。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化離心后，以5 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁24 h后，替換含不同濃度β-HB的細(xì)胞培養(yǎng)基(0、40、60、80、100、120 mmol/L)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，處理48 h后，每孔加入含10%(體積分?jǐn)?shù))的CCK8試劑的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度。

1.4 細(xì)胞糖酵解實(shí)驗(yàn)

糖酵解壓力試劑盒檢測(cè)細(xì)胞糖代謝水平。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于Seahorse XFe24專(zhuān)用24孔板中，貼壁后替換含不同濃度的β-HB培養(yǎng)基(0、60、80 mmol/L)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)前配制不含葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.4。水化Seahorse XFe24專(zhuān)用探針板12～72 h。處理細(xì)胞48 h后，將24孔板中DMEM培養(yǎng)基更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中孵育1 h。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制并稀釋葡萄糖、寡霉素及2-脫氧葡萄糖至所需濃度，加入到測(cè)試板中，按說(shuō)明書(shū)上機(jī)檢測(cè)。Seahorse XF糖酵解壓力試劑盒檢測(cè)不同濃度β-HB(0、60、80 mmol/L)作用于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后的細(xì)胞外酸化速率(extracellular acidification rate，ECAR)，并對(duì)細(xì)胞的糖酵解能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測(cè)

取經(jīng)過(guò)β-HB處理的細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)合成cDNA。以β-Actin 為內(nèi)參，Power SYBR?Green PCR Master MIX進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，引物序列：c-myc 正向序：5′-CCTGGTGCTCCATGAGGAGA-3′；反向序列:5′-CTCCAGCAGAAGGTGATCCAGA-3′；β-actin正向序列：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′；反向序列5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增條件為：50 ℃ 2 min 升溫，95 ℃ 10 min初始變性，95 ℃ 15 s 變性，60 ℃ 1 min退火延伸，其中初始變性、變性、退火延伸3步驟重復(fù)40個(gè)循環(huán)。并用2-ΔΔCT法比較表達(dá)量的差異。

1.6 Western blotting法檢測(cè)

取經(jīng)過(guò)β-HB處理的細(xì)胞，PBS洗3次，以PMSF：RIPA=1∶100的比例配置蛋白裂解液，裂解細(xì)胞提取蛋白。并用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白含量，100 ℃煮沸10 min。變性蛋白等質(zhì)量、等體積上樣于10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分離膠的聚丙烯酰凝膠中，經(jīng)電泳、電轉(zhuǎn)、洗膜后，PVDF膜用含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的1×TBST室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。第2天回收一抗，用1×TBST洗膜3次后，加入熒光二抗，室溫下避光孵育1 h，1×TBST洗膜后，用Odyssey CLx儀檢測(cè)蛋白條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 β-HB在體外對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

用不同濃度β-HB(0、40、60、80、100、120 mmol/L)處理腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后，CCK8 檢測(cè)細(xì)胞的增生情況，β-HB對(duì) LN229及U87細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制隨著藥物濃度增加而升高，呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，詳見(jiàn)圖1。

圖1 β-HB對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87及LN229的生長(zhǎng)抑制作用Fig.1 Effect of β-HB on proliferation ability in glioma cell lines U87 and LN229

2.2 β-HB對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解水平的影響

與對(duì)照組相比，β-HB處理后細(xì)胞糖酵解水平下降。在U87細(xì)胞中，3組間細(xì)胞糖酵解水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.511，P=0.000)，其中兩兩比較60 mmol/L組最大糖酵解能力為(25.53±3.07)mpH/min，與對(duì)照組相比(28.49±2.52)mpH/min差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，80 mmol/L組最大糖酵解能力為(11.83±1.49)mpH/min，與對(duì)照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在LN229細(xì)胞中，60 mmol/L組和80 mmol/L組最大糖酵解能力分別為(7.37±2.50)mpH/min、(6.11±2.03)mpH/min，與對(duì)照組相比(11.50±1.38)mpH/min明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.828，P<0.05)，詳見(jiàn)圖2。

2.3 β-HB對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞c-myc基因水平的影響

不同濃度β-HB(0、60、80 mmol/L)分別處理細(xì)胞24 h及48 h，檢測(cè)c-myc的基因及c-myc蛋白表達(dá)量。與對(duì)照組相比，在U87細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組c-myc基因表達(dá)量均下降且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1654.61，P=0.000)，LN229細(xì)胞中c-myc基因表達(dá)量均下降且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=161.94，P<0.05)，詳見(jiàn)圖3。

3 討論

葡萄糖代謝異常是腫瘤細(xì)胞的顯著特征大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為葡萄糖攝取增加、糖酵解速率加快以及乳酸生成增多。雖然糖酵解是一種低效的產(chǎn)能方式(一分子葡萄糖僅能產(chǎn)生2分子ATP，而有氧氧化可生成38或36分子ATP)，但其產(chǎn)生ATP的速率是有氧氧化的10～100倍[13]，所以通過(guò)糖酵解就能更快且更多的生成ATP，滿(mǎn)足腫瘤細(xì)胞快速增生的需要。另外，磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的NADPH及5-磷酸核苷，可以被腫瘤細(xì)胞利用，合成核酸和脂質(zhì)等生物大分子，這些都是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增生必不可少的。因此，干預(yù)這一過(guò)程為腫瘤治療提供了新思路。

KD模擬了人體的饑餓狀態(tài)，迫使機(jī)體以脂肪作為能量代謝的主要物質(zhì)。脂肪則在肝內(nèi)通過(guò)β氧化生成酮體。β-HB不僅是脂肪的代謝產(chǎn)物，其本身就具有抗腫瘤作用。在KD的基礎(chǔ)上使用酮類(lèi)補(bǔ)充劑，可以增強(qiáng)KD的效果，甚至在單獨(dú)用于某些疾病時(shí)也是有效的。此外，β-HB具有多種信號(hào)功能，包括與細(xì)胞表面受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程，并間接的改變其他代謝產(chǎn)物的水平[14]。Shukla等[15]的研究顯示，β-HB可以下調(diào)胰腺癌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glucose transporter 1，GLUT1)及乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase-A，LDHA)的表達(dá)，使細(xì)胞葡萄糖攝取、糖酵解通量及谷氨酰胺攝取量降低。

圖2 β-HB處理腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87及LN229后糖酵解水平Fig.2 Glycolytic capacity in glioma cell lines U87 and LN229 after treated with β-HB

A：U87 treated with different concentrations of β-HB；B：LN229 treated with different concentrations of β-HB；C：glycolytic capacity in U87；D：glycolytic capacity in LN229.*P<0.05，**P<0.01;β-HB:β-hydroxybutyrate;ECAR：extracellular acidification rate；2-DG：2-deoxyglucose.

圖3 β-HB處理腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87及LN229后c-myc表達(dá)水平Fig. 3 Protein and mRNA expression of c-myc after treated with β-HB in U87 and LN229

A： Expression of c-myc protein in U87 was assayed by Western blotting;B： Expression of c-myc protein in LN229 was assayed by Western blotting;C： Relative mRNA expression of U87 c-myc was determined by RT-qPCR；D： Relative mRNA expression of LN229 c-myc was determined by RT-qPCR;***P<0.001;β-HB:β-hydroxybutyrate;RT-qPCR:real-time quantitative polymerase chain reaction.

本研究中，首先探討了β-HB對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及LN229的作用，發(fā)現(xiàn)β-HB可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴(lài)性。同時(shí)，對(duì)ECAR進(jìn)行測(cè)定，筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)β-HB處理后的細(xì)胞糖酵解水平及最大糖酵解能力明顯下降，提示β-HB可能通過(guò)抑制細(xì)胞糖酵解，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。雖然本研究已經(jīng)驗(yàn)證了KD對(duì)體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用，但是由于體內(nèi)與體外腫瘤生長(zhǎng)環(huán)境的差異性，還需進(jìn)一步研究β-HB對(duì)原位腦腫瘤動(dòng)物模型的效應(yīng)。

C-myc是由myc原癌基因編碼的一種轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化及凋亡等生理過(guò)程。在結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌和腦膠質(zhì)瘤等許多腫瘤中都存在myc基因表達(dá)失調(diào)。早期研究[16]顯示，c-myc可以與LDHA的啟動(dòng)子結(jié)合并誘導(dǎo)LDHA表達(dá)增加，這將c-myc與葡萄糖代謝調(diào)節(jié)聯(lián)系起來(lái)。隨后的研究[17-18]表明，c-myc還可以調(diào)節(jié)GLUT1、己糖激酶-2(hexokinase 2，HK2)、磷酸果糖激酶-M 1(phosphofructokinase M1，PFKM1)和烯醇化酶-1(enolase 1，ENO1)的表達(dá)，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及分解代謝。

因此，腫瘤中過(guò)表達(dá)c-myc可以增強(qiáng)細(xì)胞的“沃伯格”效應(yīng)。本研究中檢測(cè)了經(jīng)過(guò)β-HB處理后細(xì)胞c-myc的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)c-myc基因及c-myc蛋白都有不同程度的降低，說(shuō)明β-HB可能通過(guò)降低c-myc基因的表達(dá)從而抑制細(xì)胞的糖酵解水平，進(jìn)而使細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯。但β-HB是否是通過(guò)c-myc調(diào)控糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶表達(dá)，亦或是其他信號(hào)通路影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的代謝還需進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究探討了β-HB在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增生及糖酵解方面的影響，證明β-HB能夠抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增生，且對(duì)其糖酵解水平的抑制也隨濃度升高而增強(qiáng)，而β-HB對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增生及糖酵解的抑制作用可能是由于下調(diào)c-myc基因?qū)е碌摹８鶕?jù)“沃伯格”效應(yīng)的原理，本研究提示KD治療腦膠質(zhì)瘤是可行的。通過(guò)高脂肪低碳水化合物的飲食方式，提高體內(nèi)β-HB濃度，或使用酮類(lèi)補(bǔ)充劑以及抑制酮體代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶使體內(nèi)β-HB維持在一個(gè)適當(dāng)?shù)臐舛?，從而達(dá)到控制腫瘤的目的，這為膠質(zhì)瘤地治療提供了新思路。