雙腎上腺素樣激酶1不同剪接體通過激活JNK通路增強胰腺癌細胞的增生能力

張媛媛 葛 洋 安廣宇

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院腫瘤科，北京 100020 )

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)胰腺癌的致死率居于腫瘤相關死因的第4位，且胰腺癌患者的5年生存率僅為5%[1]。已有研究[2-3]報道，胰腺癌中存在一種具有腫瘤干細胞特性的細胞亞群，此細胞亞群對標準放射治療及化學藥物治療方法易產(chǎn)生耐受，從而導致胰腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，探尋新型有效的胰腺癌治療策略以改善胰腺癌患者的預后及生存能力成為目前的研究熱點。雙腎上腺素樣激酶1 (doublecortin-like kinase 1，DCLK1) 是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶家族的微管結合成員，是公認的腸和胰腺腫瘤的干細胞標志物[4]。Bailey等[5]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌的侵襲和浸潤依賴于DCLK1陽性腫瘤細胞，此類細胞具有類似腫瘤干細胞的特性。人類DCLK1編碼基因位于染色體13q13.3區(qū)域，含有5′端和3′端兩個不同的啟動子序列，其中5′α 啟動子編碼DCLK1全長(約82 000，DCLK1-L, 亞型1/2，DCLK1長型)，3′β 啟動子僅編碼DCLK1的C末端激酶區(qū)域(約45 000～50 000，DCLK1-S, 亞型3/4, DCLK1短型)，形成具有不同蛋白質(zhì)結構域的剪接異構體[6]。近年的研究[7-8]結果顯示，DCLK1蛋白高表達與胰腺癌惡性程度增高密切相關，但具體研究DCLK1長、短亞型對胰腺癌生物學行為的影響尚未見報道。本研究將DCLK1長型亞型1和DCLK1短型亞型4分別轉(zhuǎn)染進胰腺癌PANC-1細胞，構建DCLK1長、短亞型的穩(wěn)定過表達細胞系，研究各亞型對胰腺癌細胞增生的影響，并探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

空載(PCMV6-AC-GFP)、DCLK1亞型1和DCLK1亞型4質(zhì)粒購于美國Origene公司。高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，Ausbian胎牛血清購自上海威正翔禹生物科技有限公司。RNA抽提試劑Trizol和LipofectamineTM3 000 試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量實時聚合酶鏈式反應(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購自日本Takara公司，所有引物均由上海生工公司合成。G418購自北京Solarbio公司。JNK抑制劑SP600125購自上海碧云天公司。Western blotting法檢測所用的RIPA蛋白裂解液、蛋白抑制劑和PMSF均購自南京恩晶生物有限公司，5×蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜和辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物均購自美國Millipore公司，DCLK1抗體購自美國Abcam公司，其余一抗均購自美國CST公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。多功能實時無標記細胞分析儀(real-time cell analysis, RTCA)由美國ACEA 生命科學公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理

人胰腺癌細胞系Aspc-1、Bxpc-3、PANC-1均購自美國ATCC細胞庫。PANC-1細胞用高糖DMEM培養(yǎng)基[含10%(體積分數(shù))FBS]，Aspc-1和Bxpc-3用RPMI培養(yǎng)基[含10%(體積分數(shù))FBS]，在37 ℃ 和5%(體積分數(shù))CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。JNK抑制劑SP600125(溶解度為15 g/L)溶于DMSO中，用DMEM培養(yǎng)基稀釋至0、40、80 μmol/L 3個濃度加入到細胞中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

分別將PAMV6-AC-GFP、DCLK1亞型1、DCLK1亞型4 3種質(zhì)粒按照LipofectamineTM3 000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染進PANC-1細胞，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入含900 μg/mL G418的培養(yǎng)基篩選至少20 d，獲得穩(wěn)定表達的3個細胞系，分為3組：PCMV6-AC-GFP(Control組)、DCLK1亞型1過表達(DCLK1 iso1 OE組)、DCLK1亞型4過表達(DCLK1 iso4 OE組)。

1.4 Western blotting法檢測蛋白表達

待細胞匯合度達到80%～90%，用預冷PBS洗滌兩次，用RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，用BCA蛋白分析試劑盒測定其濃度。取50 μg蛋白在10%(質(zhì)量分數(shù))SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，用0.2 μmol/L的PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂牛奶中封閉1 h后，孵育一抗并4 ℃過夜。隨后，用TBST洗膜3次，每次5 min，再用相應的二抗室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，最后凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結果。

1.5 qRT-PCR檢測DCLK1的表達

用Trizol提取細胞總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。DCLK1長型(DCLK1-L)、DCLK1短型(DCLK1-S)和內(nèi)參GAPDH的引物探針由上海生工公司設計合成，引物序列如下：GAPDH-F: 5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，GAP DH-R: 5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′；DCLK1-L-F: 5′-GGAGTGGTGAAACGCCTGTAC-3′，DCLK1-L-R: 5′-GG TTCCATTAACTGAGCTGG-3′；DCLK1-S-F: 5′-ACACTAAGACTGTGTCCATGTTAGAACTC-3′，DCLK1-S-R: 5′-AAG CCTTCCTCCGACACTTCT-3′。

按照qRT-PCR說明書進行反應，體系為20 μL，反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。所有反應設置3個復孔，用qRT-PCR分析軟件分析CT值，目的基因RNA相對量=2-ΔΔCT, ΔΔCT=待測樣本(CT目的基因-CT內(nèi)參)-對照組(CT目的基因-CT內(nèi)參)。

1.6 RTCA檢測細胞增生能力

取對數(shù)生長期的細胞，消化后計數(shù)，每孔6 000個細胞種于平板內(nèi)，每組設置3個復孔，整個實驗過程中，每15 min記錄一次數(shù)據(jù)，在37 ℃ 5% (體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 h，得到生長曲線。

1.7 統(tǒng)計學方法

分析DCLK1亞型1/4在胰腺癌3株細胞系中的mRNA基礎表達量時，使用Graph Pad Prism 6軟件進行方差分析，其余實驗數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism 6軟件進行t檢驗統(tǒng)計學分析，所有實驗獨立進行3次，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DCLK 1長、短亞型穩(wěn)定過表達胰腺癌細胞系的構建

用qRT-PCR和Western blotting法分別檢測胰腺癌3種細胞系中DCLK1 亞型1和DCLK1 亞型4的表達，在PANC-1細胞中，DCLK1 亞型1和DCLK1 亞型4的表達水平最低(圖1A和1B)。因此，本研究選擇PANC-1細胞株用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗。通過qPCR和Western blotting法分析證實，PANC-1細胞轉(zhuǎn)染DCLK1 亞型1和DCLK1 亞型4質(zhì)粒后，其DCLK1表達水平與Control組相比明顯升高(t=32.640，P<0.001；t=17.027，P=0.002)，成功構建了DCLK1穩(wěn)定過表達細胞系(圖1C和1D)。

圖1 構建DCLK1 亞型1和4穩(wěn)定過表達的胰腺癌細胞系Fig.1 Construction of DCLK1 isoform 1 and 4 overexpression stable cell lines in pancreatic cancer

A: mRNA expression of DCLK1 isoform 1 and 4 in three pancreatic cancer cell lines (AsPC-1, Bxpc-3, PANC-1);B: protein expression of DCLK1 isoform 1 and 4 in three pancreatic cancer cell lines;C: DCLK1 iso1/4-overexpressing (DCLK1 iso1 OE， DCLK1 iso4 OE) PANC-1 cells demonstrate a significantly upregulation in DCLK1 protein;D: DCLK1 iso1/4-overexpressing (DCLK1 iso1 OE， DCLK1 iso4 OE) PANC-1 cells demonstrate a significantly upregulation in DCLK1 mRNA expression；**P<0.01，***P<0.001;DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

2.2 DCLK1長、短亞型對PANC-1細胞體外增生能力的影響

利用RTCA檢測胰腺癌細胞的增生能力。Control組與DCLK1亞型1過表達組60 h時的細胞指數(shù)(cell index，CI)值分別為0.560±0.037，0.883±0.011；80 h時的CI值分別為0.835±0.032，1.584±0.120；100 h時的CI值分別為1.061±0.070，2.739±0.234；120 h時的CI值分別為1.780±0.007，3.857±0.007。Control組與DCLK1 亞型4過表達組60 h時的CI值分別為0.769±0.010，1.185±0.028；80 h時的CI值分別為1.074±0.018，1.799±0.042；100 h時的CI值分別為1.538±0.231，2.788±0.223；120 h時的CI值分別為2.020±0.060，3.782±0.290。DCLK1 亞型1和DCLK1 亞型4的過表達均可以顯著促進胰腺癌PANC-1細胞的增生能力(圖2)。

圖2 DCLK1亞型1和4過表達對PANC-1細胞增生能力的影響Fig.2 Effect of overexpression of DCLK1 isoform 1 and 4 on the ability of proliferation in PANC-1 cells

A：DCLK1 isoform 1 overexpression (DCLK1iso1 OE)；B： DCLK1 isoform 4 overexpression (DCLK1iso4 OE)；DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

2.3 DCLK1長、短亞型激活PANC-1細胞中的JNK通路

Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，DCLK1亞型1和DCLK1亞型4的過表達可以顯著增強c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的磷酸化水平(t=16.480，P=0.004；t=44.109，P=0.01)，而對細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和p38磷酸化水平無顯著影響(t=3.423，P=0.076；t=1.431，P=0.289；t=2.234，P=0.155；t=0.512，P=0.660)(圖3A)。為了進一步證實DCLK1對胰腺癌JNK通路的激活作用，同時檢測了JNK通路下游靶標的蛋白表達水平，JNK通路下游靶標如C-MYC(t=10.547，P=0.009；t=12.648，P=0.006)、CD44(t=7.849，P=0.016；t=18.008，P=0.003)和CyclinD1

圖3 DCLK1亞型1和4過表達對JNK通路的影響Fig.3 Effects of overexpression of DCLK1 isoform 1 and 4 on JNK pathway

A: effects of overexpression of DCLK1 isoform 1 and 4 on the protein levels of MAPK pathways such as JNK, ERK and p38;B: effects of overexpression of DCLK1 isoform 1 and 4 on the protein levels of downstream molecular markers such as C-MYC, CD44 and CyclinD1 in JNK pathway；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vscontrol group；JNK：c-Jun N-terminal kinase；ERK：extracellular regulated protein kinases；MAPK：mitogen-activated protein kinase；DCLK1：doublecortin-like kinase 1；DCLK1iso1OE： DCLK1 isoform 1 overexpression；DCLK1iso4OE：DCLK1 isoform 4 overexpression.

(t=47.437，P=0.000；t=336.459，P=0.000)的表達也顯著升高(圖3B)。

2.4 SP600125抑制JNK通路可顯著降低DCLK1的促增生能力

Western blotting法分析結果顯示，在DCLK1 亞型1和DCLK1亞型4過表達的PANC-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中，用不同濃度的JNK特異性抑制劑SP600125(40、80 μmol/L)處理細胞后，可以顯著抑制JNK的磷酸化。同時JNK通路抑制可以顯著下調(diào)DCLK1對JNK通路下游靶標CMYC、CD44和CyclinD1的激活(圖4A)，這些蛋白標志物差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。同時RTCA檢測結果顯示，DCLK1亞型1過表達細胞系中，SP600125(0 μmol/L)組與SP600125(40 μmol/L)組60 h時的CI值分別為：5.055±0.175，3.816±0.460；80 h時的CI值分別為：6.683±0.320，5.538±0.614；100 h時的CI值分別為7.652±0.442，6.544±0.327；120 h時的CI值分別為：7.506±0.472，6.058±0.178。DCLK1亞型4過表達細胞系中，SP600125(0 μmol/L)組與SP600125(40 μmol/L)組60 h時的CI值分別為：4.788±0.206，2.465±0.443；80 h時的CI值分別為：6.443±0.480，4.066±0.668；100 h時的CI值分別為8.684±0.799，5.321±0.554；120 h時的CI值分別為：8.476±0.520，5.336±0.391(圖4B)。

圖4 JNK抑制劑SP600125對DCLK1亞型1和4過表達的胰腺癌細胞增生能力的影響Fig.4 Effects of JNK inhibitor SP600125 on the proliferation of DCLK1 isoform and 4 overexpressed pancreatic cancer cells

A: treatment with the indicated concentrations of JNK inhibitor SP600125 (0, 40, 80 μmol/L) on the downstream molecular of JNK pathway at protein level in PANC-1 DCLK1 isoform 1 and 4 overexpression cells;B: proliferation abilities of PANC-1 DCLK1 isoform 1 and 4 overexpressed cells after treatment with SP600125；DCLK1 isoform 1 overexpression (DCLK1iso1 OE), DCLK1 isoform 4 overexpression (DCLK1iso4 OE)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vscontrol group；JNK：c-Jun N-terminal kinase；DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

表1 SP600125抑制JNK通路后其下游蛋白標志物的統(tǒng)計分析Tab.1 Statistical analysis of downstream protein markers after SP600125 inhibits JNK pathway

JNK：c-Jun N-terminal kinase；DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是人類癌細胞存活、播散以及抵抗藥物治療的關鍵途徑[7]。DCLK1是公認的腸道和胰腺干細胞標志物，在各種實體腫瘤(包括結直腸、胰腺、乳腺和前列腺)中均有上調(diào)[8-10]。研究[11-12]顯示，由于啟動子選擇的差異，人類DCLK1基因可編碼形成具有不同蛋白質(zhì)結構域的剪接異構體。雖然尚未對這些亞型的結構-功能關系進行詳細的研究，但研究提示這些異構體可能具有不同的亞細胞定位，發(fā)揮不同的生物學功能。本研究分別用空載PCMV6-AC-GFP、DCLK1 isoform 1和DCLK1 isoform 4 3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC-1細胞，構建穩(wěn)定表達的胰腺癌細胞系用于后續(xù)實驗。

本研究探討了DCLK1長、短亞型對胰腺癌細胞增生能力的影響及其作用機制。RTCA結果表明，DCLK1長、短亞型均促進胰腺癌細胞增生。通過評估DCLK1不同亞型對MAPK通路中JNK、ERK和p38 3個主要亞家族的影響，本研究顯示JNK通路是PANC-1細胞系中DCLK1長、短亞型的主要作用靶點。JNKs是調(diào)節(jié)炎性反應、形態(tài)發(fā)生、細胞增生、分化、存活和死亡等多種生理過程的重要蛋白激酶分子，JNKs的持續(xù)激活參與了腫瘤的發(fā)生和進展[13]。以往研究[14-16]證實，JNK信號通路激活可以上調(diào)C-myc、CyclinD1和CD44等基因的表達，這些基因在胰腺癌的增生和自我更新中發(fā)揮重要作用。因此為了進一步驗證DCLK1靶向激活JNK通路，本研究檢測了DCLK1長、短亞型對JNK通路下游分子的影響，發(fā)現(xiàn)DCLK1過表達同時增強了JNK通路下游的靶點如C-myc、CD44和CyclinD1基因的表達。所有結果都支持DCLK1長、短亞型激活胰腺癌的JNK通路。

筆者推測，DCLK1長、短亞型通過激活JNK通路增強胰腺癌細胞的增生能力。為了驗證這一假設，本研究用JNK特異性抑制劑SP600125抑制JNK通路，然后評估JNK被抑制后對DCLK1誘導的腫瘤增生能力的影響。Western blotting法檢測顯示，在DCLK1 亞型 1和DCLK1 亞型 4過表達的PANC-1細胞系中，JNK磷酸化及JNK通路下游分子如CMYC、CD44和CyclinD1的表達量均顯著降低。同時RTCA結果顯示，特異性抑制JNK后顯著下調(diào)了DCLK1長、短亞型的促增生能力。綜上所述，DCLK1長、短亞型通過激活JNK通路促進胰腺癌的增生能力，從而加速胰腺癌的發(fā)生與進展。