芪參益氣滴丸通過TRPC1/STIM1通路調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用

胡武明， 施振華， 葉士勇， 向貽佳， 曾春來

(麗水市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科， 浙江 麗水 323000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為全球主要致死性心腦血管疾病，其發(fā)病率逐年上升[1]。大量臨床研究以及動物實驗證實，AS的發(fā)生與脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)，如血液中甘油三酯(triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol，TC)異常增加引起的脂質(zhì)沉積是AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[2]。不健康的生活方式，大量攝入高脂食物，生活壓力過大以及運動減少等是誘導(dǎo)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致AS形成的主要原因[3]。血管內(nèi)皮具有調(diào)節(jié)血管壁收縮和血栓形成的作用，血管內(nèi)皮功能障礙也是AS和其它心腦血管疾病發(fā)生的預(yù)測指標(biāo)之一[4]。因此，減輕高血脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷對于AS的防治具有重要意義。

鈣離子(Ca2+)是細(xì)胞中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)離子，參與胞內(nèi)Ca2+釋放及胞外Ca2+內(nèi)流的細(xì)胞信號傳遞[5]。血管內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流可以通過刺激舒張因子一氧化氮(nitric oxide，NO)的釋放維持血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，參與抵御血管疾病的作用[6]。鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channel，SOCC)可通過調(diào)控其結(jié)構(gòu)蛋白瞬時受體電位通道蛋白1(tran-sient receptor potential channel protein 1，TRPC1)和基質(zhì)交互分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，在血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用[7]。本項工作以AS模型大鼠為研究對象，通過檢測TRPC1/STIM1介導(dǎo)的SOCC探討芪參益氣滴丸(Qishen-Yiqi dripping pills,QS)在治療AS中的作用機制。

材 料 和 方 法

1 藥品與試劑

芪參益氣滴丸購自天津天力士制藥股份有限公司(Z20030139)；阿托伐他汀購自輝瑞制藥有限公司(H20051408)；抗TRPC1(ab51255)、STIM1(ab108994)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)(ab76198)和GAPDH(ab8245)抗體購自Abcam；NO測定試劑盒(硝酸還原酶法)、白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購自南京建成生物研究所。

2 實驗動物與分組

雄性SPF級SD大鼠36只，8周，體重(230±20) g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(浙)2014-008。采用數(shù)字隨機法將實驗動物隨機分為正常對照(control，Con)組 (n=6)和AS模型組(n=30);AS模型建立后隨機分為:模型(model)組(n=6)，芪參益氣滴丸低(low-dose QS)、中(middle-dose QS)、高劑量(high-dose QS)組(均n=6),陽性對照(positive control,PC)組(n=6)。芪參益氣滴丸使用蒸餾水配制成135 kg/L(低劑量)、270 kg/L(中劑量)和300 kg/L(高劑量)，按1 mL/kg的體積灌胃，每天1次；陽性對照組每天灌胃1次阿托伐他汀，2.5 mg/kg。

3 主要方法

3.1AS模型建立 AS模型組動物給予高脂飼料(2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.5%膽酸鈉、8%全脂奶粉和69.5%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，每天30～40 g，自由飲水，定期觀察體重、飲水以及活動情況，正常對照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)6周。從第7周開始處理組采用灌胃法分別給予芪參益氣滴丸處理，陽性對照組給予氟伐他汀處理，正常組和模型組灌胃同等體積蒸餾水。實驗12周后使用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，心臟采血，取動脈組織保存于-80 ℃或固定于4%的多聚甲醛中備用。

3.2HE染色觀察大鼠主動脈病理變化 將固定于多聚甲醛中的動脈組織取出，使用濃度梯度乙醇脫水后使用二甲苯透明，然后經(jīng)石蠟包埋后切片。將切片使用二甲苯進行脫蠟，蒸餾沖洗后使用蘇木精染色，1%鹽酸分色20 s，流水沖洗后0.5%伊紅染色，乙醇脫水透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

3.3血清中血脂、Ca2+濃度和炎癥因子水平檢測 血液收集后，靜置30 min，然后1 500×g離心10 min，分離血清后分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆?。使用全自動生化分析儀檢測TG、TC、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、Ca2+水平；使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

3.4硝酸還原酶法檢測動脈組織中NO含量 根據(jù)試劑盒說明書，準(zhǔn)確稱取大鼠動脈組織，根據(jù)重量體積1∶9加入生理鹽水制備10%的組織勻漿液，離心取上清根據(jù)試劑盒說明書加樣，于550 nm波長下檢測吸光度(A)值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計算NO濃度。

3.5Western blot檢測動脈組織中TRPC1、STIM1和eNOS蛋白表達(dá)水平 取大鼠動脈組織50 mg于1.5 mL EP管中并加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液1 mL，每管加入2粒玻璃珠，勻漿器勻漿后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清保存?zhèn)溆?。使用BCA試劑盒進行蛋白定量。每組取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，檢測TRPC1、STIM1和eNOS蛋白表達(dá)情況；以GAPDH作為內(nèi)參照，使用BandScan 5.0軟件進行圖像分析。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件進行所有結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及SNK-q檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 芪參益氣滴丸對大鼠動脈組織結(jié)構(gòu)的影響

對照組大鼠動脈組織血管壁光滑完整，無脂質(zhì)沉積和斑塊引起的血管狹窄現(xiàn)象；與對照組相比，AS模型大鼠血管內(nèi)膜明顯增厚,血管狹窄,粥樣硬化斑塊形成；芪參益氣滴丸處理后AS大鼠血管內(nèi)膜增厚和血管狹窄明顯減輕，見圖1。

Figure 1.The histopathological changes of rat arterial (HE staining, scale bar=50 μm). Arrow: atherosclerotic plaque and intimal thickening; oval: reducing the formation of plaque.

圖1大鼠動脈組織病理學(xué)變化

2 芪參益氣滴丸對AS大鼠血脂水平的影響

使用全自動生化分析儀檢測大鼠血液TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，AS模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C顯著升高，HDL-C的水平顯著減低(P<0.05)；與AS組相比，高劑量芪參益氣滴丸處理后大鼠TC、TG和LDL-C水平顯著降低，HDL-C的水平顯著升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The serum lipid levels of rats in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAS group;▲P<0.05vslow-dose QS group.

圖2各組大鼠血脂水平變化

3 芪參益氣滴丸對AS大鼠血清炎癥因子水平的影響

與對照組相比，AS組大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平顯著升高(P<0.05)；與AS組相比，芪參益氣滴丸處理以后大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The serum levels of inflammatory factors IL-1β, IL-6 and TNF-α of rats in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAS group;▲P<0.05vslow-dose QS group.

圖3各組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平變化

4 芪參益氣滴丸對AS大鼠血清Ca2+和動脈組織中NO水平影響

與對照組相比AS大鼠血清中Ca2+顯著升高和動脈組織中NO水平顯著降低(P<0.05)；與AS大鼠相比芪參益氣滴丸處理后大鼠血清中Ca2+顯著降低和動脈組織中NO水平顯著升高(P<0.05)，且芪參益氣滴丸高劑量組和中劑量組Ca2+顯著低于低劑量組，NO水平顯著高于低劑量組(P<0.05),見圖4。

Figure 4.The serum Ca2+level (A) and arterial tissue NO level (B) of rat in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAS group;▲P<0.05vslow-dose QS group.

圖4大鼠血清Ca2+水平和動脈組織中NO水平變化

5 芪參益氣滴丸處理對AS大鼠動脈組織中TRPC1、STIM1和eNOS蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，AS大鼠動脈組織中TRPC1和STIM1蛋白表達(dá)顯著升高，eNOS蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與AS大鼠相比，芪參益氣滴丸處理后TRPC1和STIM1蛋白表達(dá)顯著降低，eNOS蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且芪參益氣滴丸高劑量組對TRPC1、STIM1和eNOS蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.Western blot analysis of TRPC1, STIM1 and eNOS protein expression levels in rat arterial tissues. Mean±SD. n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAS group;▲P<0.05vslow-dose QS group.

圖5大鼠動脈組織中TRPC1、STIM1和eNOS蛋白表達(dá)水平變化

討 論

AS是一種慢性免疫疾病，其病理過程表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞并聚集在血管壁，誘發(fā)炎性細(xì)胞因子的釋放，從而導(dǎo)致脂質(zhì)堆積形成斑塊，堵塞血管[8]。AS的發(fā)生是多種致病因素綜合作用的結(jié)果，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞損傷、血脂代謝異常、血小板聚集、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等。在高血脂等因素作用下，低密度脂蛋白能夠通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，降低血管舒張因子NO的合成釋放，引起血管舒張障礙以及平滑肌細(xì)胞損傷，是AS形成的關(guān)鍵[9]。

芪參益氣滴丸主要由黃芪、丹參、三七和降香等中藥組成。黃芪中含有的黃芪多糖和黃酮類化合物具有溫補心氣、活血化瘀、改變血管通透性的作用；丹參和三七具有通經(jīng)活絡(luò)的作用。因此，芪參益氣滴丸具有益氣活血、通經(jīng)活絡(luò)、擴張血管的作用。研究顯示芪參益氣滴丸對冠心病患者血脂代謝紊亂具有良好的調(diào)節(jié)作用，可以通過降低TC、LDL以及提高HDL延緩冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)展[10]。本研究結(jié)果表明芪參益氣滴丸能夠顯著降低AS大鼠血清中TC、TG、LDL-C同時提高HDL-C的水平，提示芪參益氣滴丸可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝減緩AS的發(fā)展。宋郁珍等[11]也證實芪參益氣滴丸可以調(diào)節(jié)高膽固醇血癥家兔脂質(zhì)代謝紊亂。

炎癥反應(yīng)在AS病變起始、斑塊破裂以及血栓形成過程中發(fā)揮重要作用。臨床研究表明，AS患者血清中的炎癥因子水平如IL-1β、IL-6和TNFα水平顯著提高[12-13]。IL-1β和IL-6具有廣泛的炎癥誘導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)作用，可以通過炎癥反應(yīng)以及脂質(zhì)代謝促進AS的發(fā)展[14]。TNF-α可以通過促進LDL的生成和降低HDL的合成，誘導(dǎo)脂類代謝異常。此外，TNF-α還可以通過抑制eNOS的合成，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，從而加速AS的形成和發(fā)展[15-16]。本研究中芪參益氣滴丸可通過降低AS大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，減輕AS大鼠炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗AS作用。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體功能，介導(dǎo)AS的發(fā)展。已有研究證實動脈粥樣硬化斑塊中的Ca2+濃度顯著高于正常組織[17]。血管組織中Ca2+穩(wěn)態(tài)與SOCC密切相關(guān)。當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞中Ca2+過度消耗以后，會引起STIM1激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，與TRPC1結(jié)合形成SOCC，介導(dǎo)鈣庫操縱性鈣內(nèi)流，提高胞內(nèi)Ca2+濃度[18]。Wang等[19]表明誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流可以通過降低冠狀動脈血管平滑肌細(xì)胞活性，促進AS的發(fā)展，但沉默TRPC1或阻斷鈣庫操縱性鈣內(nèi)流后AS發(fā)展受到抑制。本研究中芪參益氣滴丸處理后大鼠動脈組織中TRPC1和STIM1的蛋白表達(dá)顯著降低，說明芪參益氣滴丸可以通過降低TRPC1/STIM1誘導(dǎo)的Ca2+升高，減輕動脈粥樣硬化引起的血管內(nèi)皮損傷。目前研究發(fā)現(xiàn)Ca2+穩(wěn)態(tài)是激活eNOS合成NO的關(guān)鍵因素。生理條件下eNOS可以通過合成NO，舒張血管，發(fā)揮血管保護作用。研究表明，血管緊張素可以誘導(dǎo)豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+濃度升高，同時eNOS和NO的表達(dá)下降[20]。本研究中AS大鼠動脈組織中eNOS水平顯著降低，芪參益氣滴丸處理后AS大鼠動脈組織中eNOS水平顯著升高，表明芪參益氣滴丸可以通過誘導(dǎo)eNOS分泌，促進NO的合成釋放，降低血管內(nèi)皮損傷，從而發(fā)揮對AS的保護作用。

綜上所述，芪參益氣滴丸可用通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝以及抑制炎癥反應(yīng)，抑制AS的發(fā)展。此外，芪參益氣滴丸可以通過下調(diào)TRPC1和STIM1的表達(dá)，降低SOCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，增加動脈組織eNOS表達(dá)，促進NO的合成釋放，發(fā)揮AS保護作用。本研究結(jié)果明確了SOCC介導(dǎo)的Ca2+穩(wěn)態(tài)在芪參益氣滴丸抗AS中的作用機制，為揭示芪參益氣滴丸在心血管疾病中的保護作用提供參考資料。