苯并[a]芘對毛霉EPS 特征的影響

唐 蕊，邵 紅，賈春云，張作金，陳 祥

（1.沈陽化工大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，沈陽 110142；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016；3.遼寧科技大學(xué)，遼寧鞍山 114051；4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

多 環(huán) 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類普遍存在于環(huán)境中，性質(zhì)穩(wěn)定、難于降解，具有潛在的致畸、致癌、致突變作用的持久性有機(jī)污染物，對生態(tài)環(huán)境和人類健康都帶來了極大的威脅[1]，而苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene，BaP）是PAHs中具有代表性的強(qiáng)致癌物質(zhì)之一。微生物具有很強(qiáng)的PAHs分解代謝能力和較高的代謝速率，且具有成本低、效率高、不易造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)[2]。通過改進(jìn)菌種的篩選技術(shù)，從PAHs污染的土壤中篩選出高效降解PAHs的細(xì)菌、真菌和藻類等[3]，如Li等[4]利用微生物菌群降解石油污染土壤和泥漿中的PAHs，去除率分別達(dá)到50.1%和55.4%。自然界中已探明具有降解PAHs能力的細(xì)菌包括分支桿菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞桿菌屬等[5]。與細(xì)菌相比，真菌能降解PAHs的種類相對較少，但降解PAHs的效率卻往往高于細(xì)菌，尤其在降解環(huán)數(shù)較高的PAHs方面具有明顯優(yōu)勢。在降解PAHs的過程中，微生物的胞外聚合物（Extracellular polymertic substances，EPS）在 降 解PAHs方面引起研究者的極大興趣。

微生物EPS是細(xì)菌或真菌分泌體外的一類有機(jī)高分子多聚化合物，主要聚集在細(xì)胞外部形成保護(hù)層以抵制外界環(huán)境的壓力，同時也起到儲備碳源和能源的作用。EPS可以提高多環(huán)芳烴等疏水性物質(zhì)的傳質(zhì)作用而有利于生物降解，通過范德華力或者乳化作用解吸PAHs，增強(qiáng)PAHs的生物可利用性。同時有些菌種的EPS由于本身含有氧化還原酶，能直接實(shí)現(xiàn)對多環(huán)芳烴的降解[6]。Zhang等[7]通過研究EPS對生物膜的控制形成及菲、芘的生物降解行為，提出EPS可以提高難溶性PAHs的生物利用度從而增強(qiáng)生物降解效率。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)EPS具有線性晶體結(jié)構(gòu)，含有較豐富的羥基、羧基及氨基等官能團(tuán)，對污染物PAHs的去除起到一定的作用。同時，EPS中多種官能團(tuán)在溶液中離子化所表現(xiàn)出表面負(fù)電荷性，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)-多糖反應(yīng)、疏水反應(yīng)、氫鍵、離子反應(yīng)的發(fā)生[9]，進(jìn)而可以增強(qiáng)EPS與BaP的相互作用，增加BaP的溶解量。

為了更好地認(rèn)識PAHs對微生物EPS的性質(zhì)的影響，以毛霉（Mucorsp.）為研究對象，以BaP為目標(biāo)污染物，用加熱法提取毛霉EPS，研究PAHs對毛霉EPS主要成分和特性的影響，探索在BaP作用下毛霉EPS的變化特征，進(jìn)一步完善PAHs污染土壤的微生物降解機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗用菌及培養(yǎng)

毛霉（Mucorsp.）菌種由中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所土壤污染生態(tài)組提供。培養(yǎng)基配方：斜面培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯去皮后洗凈，稱取200 g切成小塊，加1 L水煮沸20 min，濾去土豆塊，冷卻后加入20 g葡萄糖，用水定容至1 L，pH自然，1.013 25×105Pa，滅菌 30 min。種子培養(yǎng)基：蔗糖 4.0%，（NH4）2HPO40.4%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，維生素 B10.005%，pH 6.5。在250 mL三角瓶中裝入液體種子培養(yǎng)基150 mL，高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后接入篩選出的菌種，在搖床上振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速120 r·min-1，培養(yǎng)至菌絲球長好為止[10]。

1.2 毛霉對苯并[a]芘的降解實(shí)驗

將已經(jīng)在斜面上馴化好的真菌轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3 d。制備成菌懸液，按10%接種量接種到BaP濃度均為10、20、40、80、120 mg·L-1的30 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃、130 r·min-1下振蕩培養(yǎng)，取樣分析培養(yǎng)基中BaP的殘留濃度。

1.3 毛霉生物量的測定

由于毛霉菌體呈球狀，所以測定生物量所用菌體采用整瓶培養(yǎng)物全部過濾，于110℃下烘干至恒質(zhì)量，使用萬分之一天平稱量毛霉的生物量。

1.4 毛霉EPS的提取方法

取培養(yǎng)后的菌體培養(yǎng)液30 mL，于2000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，補(bǔ)充無菌水至原體積，于2000 r·min-1離心3 min，棄去上清液，補(bǔ)充無菌水至原體積，重復(fù)2次，去除液體培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，然后用加熱法提取EPS。將上述菌懸液放入60℃的水浴鍋中加熱30 min，然后樣品在8000 r·min-1下離心10 min，上清液經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后，得到的無色透明溶液為EPS溶液[11]。取加熱法提取的EPS樣品，通過mulit N/C 3000TOC測定儀測定。為了在生物量相同的基礎(chǔ)上進(jìn)行EPS含量的比較，本文以單位生物量所產(chǎn)生的TOC值代表毛霉EPS的含量，單位為mg·g-1。

1.5 苯并[a]芘的提取和測定方法[11]

培養(yǎng)基中BaP采用二氯甲烷萃取，將培養(yǎng)基溶液過0.45–m水相濾器，然后向濾后溶液中加入等體積的二氯甲烷，放入振蕩器振蕩20 min，28℃，轉(zhuǎn)速170 r·min-1，全部移入50 mL分液漏斗中，靜置30 min，分層后將下層有機(jī)相存入燒杯，每一樣品按此步驟重復(fù)萃取3次。將萃取液混勻，轉(zhuǎn)移至燒杯中使用氮?dú)獯抵两?，最后? mL甲醇定容過0.22–m有機(jī)濾膜后移入液相色譜專用進(jìn)樣瓶中。

采用高效液相色譜法（Agilent-1200高效液相色譜儀）測定。色譜儀主要設(shè)定參數(shù)為：流動相為100%甲醇；流速為0.8 mL·min-1；VWD檢測波長為254 nm；柱箱溫度為35℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.6 分析方法

1.6.1 毛霉EPS組成成分含量測定

EPS中的糖類含量采用硫酸-苯酚法[8]測量；蛋白質(zhì)和腐植酸含量采用修正的Folin-Lowry法[12]測量；DNA含量采用二苯胺法[13]測量。為了在生物量相同的基礎(chǔ)上進(jìn)行比較，本文以單位生物量所產(chǎn)生的成分含量代表毛霉EPS的組成成分含量，單位為g·g-1。

1.6.2 EPS三維熒光光譜分析

提取的EPS樣品可直接進(jìn)行三維熒光測定。熒光光度計參數(shù)設(shè)定：發(fā)射掃描波長250～650 nm，激發(fā)掃描波長200～550 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm，掃描速度為12 000 nm·min-1，響應(yīng)時間為自動方式，掃描光譜進(jìn)行儀器自動校正[14]。

1.6.3 EPS紅外光譜分析

紅外光譜測定方法：將提取到的EPS經(jīng)真空干燥（-60℃，24 h），取適量的粉末進(jìn)行測定。用NICOLET380傅里葉紅外光譜儀，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次·min-1，測定范圍4000～500 cm-1[15]。

1.6.4 EPS形貌特征分析

環(huán)境掃描電子顯微鏡檢測（ESEM）：將準(zhǔn)備好的EPS樣品冷凍干燥成粉末狀，將制備好的EPS粉末粘于樣品臺上，鍍金后照相檢測。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)用Excel 2016統(tǒng)計，用Origin 2015處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度BaP誘導(dǎo)下對毛霉EPS分泌量的影響

由圖1可見，當(dāng)BaP的濃度為0 mg·L-1時，單位生物量產(chǎn)生的毛霉EPS的含量為1080 mg·g-1，EPS含量隨著BaP濃度的增加而增加，當(dāng)BaP的濃度增加到40 mg·L-1時，單位生物量產(chǎn)生的毛霉EPS的提取量達(dá)到最大值為1407 mg·g-1，而當(dāng)BaP濃度為80 mg·L-1開始，則單位生物量產(chǎn)生的毛霉EPS的提取量發(fā)生了明顯的降低，說明濃度小于40 mg·L-1時在共代謝的作用下可以促進(jìn)真菌EPS的分泌，而過高濃度的BaP則對毛霉EPS的提取起到抑制作用。多環(huán)芳烴具有一定的毒性，同時也是一種可被微生物利用的碳源，培養(yǎng)基中其他底物的存在可以對BaP的代謝降解產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用[16]。隨著BaP濃度由10 mg·L-1增加到120 mg·L-1，毛霉對BaP的降解率呈明顯下降趨勢，由75.78%下降到25.45%，這說明底物BaP的濃度越高越難代謝。

EPS含有較豐富的羥基、羧基及氨基的官能團(tuán)，對污染物的去除起到很大的作用，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)-多糖反應(yīng)、疏水反應(yīng)、氫鍵、離子反應(yīng)的發(fā)生[8]，進(jìn)而可以增強(qiáng)EPS與BaP的相互作用，增加BaP的溶解量，故隨著研究中BaP濃度的增大，代謝速率也增加。EPS在代謝降解PAHs過程中的作用主要包括：固定作用、增溶作用、保護(hù)作用和吸附作用。EPS可以通過增加疏水性而增大PAHs在土壤中的移動性，阻礙微生物細(xì)胞同有害物質(zhì)的直接結(jié)合消化[17]。Jia等[11]發(fā)現(xiàn)毛霉是一種高效多環(huán)芳烴降解菌種，毛霉單獨(dú)降解BaP的降解率可達(dá)81%，添加EPS后的毛霉降解BaP的降解率可達(dá)88%，EPS先與PAHs結(jié)合使其從污染物體系中分離出來，轉(zhuǎn)而使PAHs到達(dá)微生物表面進(jìn)行降解，EPS可以一定程度上增強(qiáng)PAHs的生物可降解性。同時底物濃度的增加刺激毛霉代謝速率的增長，毛霉EPS的含量呈先增大后減少的趨勢，EPS提取量不斷變化的原因可能是受BaP在其中的解吸速度的影響。由于BaP在初始解吸速度較快且容易解吸，解吸下的BaP濃度相對較高，溶液中生物可利用的BaP底物濃度大，代謝速率快，此時解吸不是降解的限制因素[15]。

2.2 不同濃度BaP誘導(dǎo)下對毛霉EPS主要成分的影響

圖1 不同濃度苯并芘誘導(dǎo)后毛霉EPS的提取量和降解率Figure 1 EPS concentrations and PAHs degradation after Mucor sp.induced by BaP

由圖2可知，毛霉的EPS四種主要成分含量由高到低依次為糖類、蛋白質(zhì)、腐植酸、DNA。隨著BaP濃度的增加，EPS中單位生物量所含的糖類、蛋白質(zhì)和腐植酸的含量均呈先增加后減少的規(guī)變化趨勢，但是DNA的量基本不變，原因是毛霉屬于真核微生物，其DNA多數(shù)在細(xì)胞核內(nèi)，而實(shí)驗采用加熱法提取毛霉EPS，對細(xì)胞損壞較小，不會破壞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，故DNA含量基本保持不變[18]。當(dāng)BaP濃度為40 mg·L-1時，EPS中單位生物量產(chǎn)生的糖類含量為700 g·g-1，蛋白質(zhì)含量為563 g·g-1，腐植酸的含量為174 g·g-1，均為同類中的最大值。

毛霉菌對BaP進(jìn)行代謝的過程中其EPS可有效阻止化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而且EPS中各種成分含有影響微生物聚集體的黏附和沉降特性的官能團(tuán)，與有機(jī)物有效結(jié)合[19]。當(dāng)BaP濃度小于40 mg·L-1時，微生物以BaP為碳源和能源，促進(jìn)了EPS的產(chǎn)生；當(dāng)BaP濃度達(dá)到80 mg·L-1，微生物數(shù)量和EPS也逐漸減少，因此微生物EPS的提取量以及糖類、蛋白質(zhì)和腐植酸的含量呈現(xiàn)先增大后減小的一般趨勢。EPS中的葡萄糖對微生物代謝降解土壤中BaP的中后期起到了明顯促進(jìn)作用，EPS對BaP的代謝過程可以利用其中的多糖部分進(jìn)行增溶作用[18]。

2.3 不同濃度BaP誘導(dǎo)下對毛霉EPS紅外光譜分析

圖3 以不同BaP作為底物的M.mucedo EPS的FTIR光譜Figure 3 FTIR spectra of EPS from M.mucedo with different BaP as substrate

圖2 不同BaP濃度下EPS各生化成分含量Figure 2 The content of EPS in different BaP concentrations

將圖 3中的 b、c、d、e、f與a比較可知，a中 3346 cm-1處寬而大的蛋白峰在b、c、d、e、f中分別為3217、3217、3360、3360、3382 cm-1，其中b、c中的C-O鍵的伸縮振動向低波數(shù)移動了129 cm-1，C-O鍵鍵長縮短，吸收峰發(fā)生紅移與細(xì)胞中羰基、羧基、烷氧基、氨基、羥基的存在有關(guān)[20]，而d、e、f中C-O鍵的伸縮振動向高波數(shù)移動了14、14、36 cm-1，C-O鍵鍵長增加，吸收峰發(fā)生藍(lán)移則與大分子量物質(zhì)分解形成小分子物質(zhì)有關(guān)[21]，說明在BaP誘導(dǎo)毛霉時EPS中的蛋白質(zhì)參加了反應(yīng)。a中1555 cm-1為酰胺（O=CN-H）Ⅰ帶，是C=O的伸縮振動，BaP誘導(dǎo)后從1555 cm-1分別移動到1646、1646、1621、1646、1632 cm-1，吸收峰發(fā)生藍(lán)移，與沒有BaP誘導(dǎo)的毛霉EPS相比，這說明在不同BaP濃度的誘導(dǎo)下，毛霉的代謝活性發(fā)生改變，蛋白質(zhì)中的羥基和酰胺基發(fā)生了變化，更多BaP大分子發(fā)生代謝分解。Karunakaran等[15]通過冰醋酸-離心法從污泥中提取蠟樣芽孢桿菌中的EPS，其光譜結(jié)果說明蠟樣芽孢桿菌EPS的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶分別在1695 cm-1和1545 cm-1。a中1038 cm-1處峰在不同濃度 BaP 誘導(dǎo)后的 b、c、d、e、f中分別移至1073、1069、1041、1073、1046 cm-1，說明EPS中多糖上的-COO被消耗，減少了-COO的含量。由此說明，在不同BaP濃度的誘導(dǎo)下，EPS的主要成分蛋白質(zhì)和糖類促進(jìn)了毛霉代謝過程的進(jìn)行。

2.4 不同濃度BaP誘導(dǎo)下對毛霉EPS三維熒光光譜分析

根據(jù)Chen等[22]對天然環(huán)境中各種溶解有機(jī)質(zhì)激發(fā)/發(fā)射（Ex/Em）熒光峰的位置進(jìn)行歸納，由圖4可知，類蛋白熒光峰 Peak A：Ex/Em=230～240/300～400 nm；類蛋白熒光峰Peak B：Ex/Em=230～290/350～400 nm。這兩個峰據(jù)研究為蛋白質(zhì)樣峰，主要為芳族蛋白質(zhì)樣物質(zhì)如酪氨酸（峰A）和色氨酸蛋白樣物質(zhì)（峰B）相關(guān)，可以證明蛋白質(zhì)是EPS的主要成分。熒光峰Peak C：Ex/Em=350～381/350～390 nm，此峰位類腐植酸所在區(qū)域。熒光峰Peak D：Ex/Em=280～364/280～367 nm，此峰位類可溶性微生物副產(chǎn)品所在區(qū)域。熒光峰Peak E：Ex/Em=240～245/494～498 nm，此峰位類富里酸所在區(qū)域。

由圖4和表1可知，當(dāng)BaP的濃度由10 mg·L-1增加到40 mg·L-1，對毛霉向胞外分泌蛋白都有一定的促進(jìn)作用，其中BaP的濃度為40 mg·L-1時，蛋白峰強(qiáng)度達(dá)到最大值；當(dāng)BaP的濃度由80 mg·L-1增加到120 mg·L-1時，蛋白峰強(qiáng)度呈下降趨勢，也就是說，大于80 mg·L-1的BaP抑制了毛霉向胞外分泌蛋白。當(dāng)BaP處于低濃度的時候，BaP不利于與毛霉菌體充分接觸，使得毛霉可利用的能源物質(zhì)較少，菌體的生長代謝較慢。隨BaP濃度的不斷增大，毛霉的代謝活性不斷增強(qiáng)，降解酶系較為活躍，所以蛋白峰強(qiáng)度明顯增加。真菌代謝降解PAHs過程中，主要產(chǎn)生單加氧酶，在此酶的作用下，氧原子被加入到多環(huán)芳烴分子中，形成芳香氧化物。芳香氧化物經(jīng)過結(jié)構(gòu)重組形成酚類，酚類通過環(huán)氧化物水解酶的作用形成反式雙氫乙醇，使苯環(huán)裂解，苯環(huán)數(shù)逐漸減少直至全部裂解開環(huán)[23]。毛霉具有分泌多種胞外蛋白酶的能力[24]，而且其胞外蛋白酶系對PAHs有相對較強(qiáng)的降解能力。Zhu等[25]采用加熱法分別提取污泥絮凝體、厭氧污泥和好氧污泥中的EPS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪氨酸的激發(fā)/發(fā)射波長（Ex/Em）在220～230/340～370 nm，色氨酸的激發(fā)/發(fā)射波長（Ex/Em）在280/335～355 nm，并且發(fā)現(xiàn)類蛋白峰強(qiáng)度的改變意味著其在生物代謝降解過程中發(fā)揮重要作用。

2.5 不同濃度BaP誘導(dǎo)下對毛霉EPS形貌特征分析

由圖5可知，毛霉EPS呈板結(jié)塊狀，四周凸起部分呈鋒利薄片狀。隨著BaP的濃度的改變，EPS粉末片逐漸變得松散，而且孔隙也在增加，其中40 mg·L-1BaP誘導(dǎo)得到的毛霉EPS呈毛絨狀，這時的孔隙量和大小均達(dá)到最大值，而濃度由80 mg·L-1增加到120 mg·L-1BaP誘導(dǎo)的毛霉EPS粉末又逐漸變得板結(jié)、成塊、孔隙減少。EPS能夠通過架橋作用使微生物群體形成三維結(jié)構(gòu)，使微生物間的結(jié)合更緊密，更好地進(jìn)行生化作用，微生物顆粒結(jié)構(gòu)更堅固。在EPS含量增加的同時，在BaP的影響下，毛霉EPS粉末又逐漸變得板結(jié)、成塊、孔隙減少。EPS吸附BaP后，會增大變松散，破壞了原有的結(jié)構(gòu)的紊亂度[26]，從而有利于BaP的傳質(zhì)。Nielsen等[27]認(rèn)為EPS與細(xì)胞表面結(jié)合較緊密，主要利用其微生物細(xì)胞的莢膜、松散或緊密結(jié)合的聚合物來吸附有機(jī)物，吸附有機(jī)物后的EPS會發(fā)生變化，打破原有的結(jié)構(gòu)。

表1 不同濃度BaP誘導(dǎo)下毛霉EPS三維熒光光譜分析結(jié)果Table 1 Different concentrations benzo[a]pyrene induced EPS dimensional fluorescence spectroscopy results

圖4 不同濃度BaP誘導(dǎo)下毛霉EPS三維熒光光譜Figure 4 3D EEM fluorescence spectroscopy of M.mucedo with different BaP as substrate

3 結(jié)論

（1）污染物BaP的濃度由0增加到120 mg·L-1，毛霉EPS的提取量呈現(xiàn)先增大后減小的一般趨勢，提取EPS中的糖類、蛋白質(zhì)和腐植酸均呈先增大后減小的規(guī)律性變化，而DNA的量基本不變，且各含量最大值均發(fā)生在BaP為40 mg·L-1時，說明BaP在小于40 mg·L-1時在共代謝的作用下可以促進(jìn)真菌EPS的分泌。

圖5 馴化后毛霉EPS的電鏡圖Figure 5 Electron microscopy of EPS from M.mucedo after acclimation

（2）由紅外光譜和三維熒光光譜可知，隨著污染物BaP濃度的增加，毛霉EPS的蛋白峰強(qiáng)度呈先增大后減小的趨勢，在40 mg·L-1BaP誘導(dǎo)下蛋白峰強(qiáng)度達(dá)到最大值。而且毛霉EPS的細(xì)胞蛋白質(zhì)酰胺帶發(fā)生了紅移現(xiàn)象，說明在毛霉代謝BaP時，EPS中蛋白質(zhì)和多糖起到了主要作用。

（3）通過掃描電鏡照片分析，毛霉EPS呈板結(jié)塊狀，四周凸起部分呈鋒利薄片狀，隨著污染物BaP的濃度的增加，EPS粉末片又逐漸變得板結(jié)、成塊、孔隙減少，破壞了EPS原有的結(jié)構(gòu)的紊亂度。