二甲雙胍對直腸癌細(xì)胞放療敏感性的影響

孫玉成 劉曉巍 片光哲

作者單位：133000 延吉 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院普外科

放療是直腸癌重要的治療手段，可以提高保肛率和增加手術(shù)切除率，還可延長復(fù)發(fā)患者生存期，提高生活質(zhì)量［1］。然而，直腸癌對放療的敏感性存在較大個(gè)體差異，部分患者有放療抵抗，嚴(yán)重影響放療效果［2］。二甲雙胍（DMBG）是傳統(tǒng)的降糖藥物，近年來在抗腫瘤方面的作用引起了研究者的關(guān)注。有研究表明，DMBG可增加卵巢癌對化療藥物的敏感性［3］，在胰腺癌、鼻咽癌、宮頸癌放療中也具有一定增敏作用［4-6］，而其對直腸癌放療的增敏作用，目前相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究從體內(nèi)外觀察DMBG對直腸癌放療敏感性的影響并探討其可能的作用機(jī)制，為提高直腸癌放療療效尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

直腸癌SW1463細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，4～5 d傳代1次，傳代5次后置于-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)所用裸鼠為近交系雌性BALB/c裸鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，8～10 周齡，質(zhì)量為 20～23 g，具有相同遺傳背景，共50只，在延邊大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室SPF級條件下飼養(yǎng)，裸鼠健康狀況良好（合格證號：SCXK 20080002）。實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)和處理經(jīng)延邊大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理管理委員會審核同意。

鹽酸二甲雙胍購自上海廣銳生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Life Technologies公司，MTT試劑盒購自美國Sigma公司，γ-H2AX、DNA-PK蛋白檢測試劑盒、兔抗γ-H2AX多克隆抗體購自美國Trevigen公司，β-actin抗體、鼠抗DNA-PK單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，CO2恒溫箱購自美國Thermo Scientific公司，酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，Clinac 600C/D型直線加速器購自美國Varian公司，凝膠圖像分析管理系統(tǒng)為北京科創(chuàng)銳新生物凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 MTT法檢測細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期直腸癌SW1463細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/L，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，分別接種于96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組加入用PBS配制的DMBG，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參照相關(guān)文獻(xiàn)［7］，使DMBG終濃度分別為5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L；對照組僅用等量PBS液處理，每組設(shè)調(diào)零組，加入MTT液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后按美國Sigma公司MTT試劑盒說明書要求和步驟操作，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處光密度值D（λ），計(jì)算細(xì)胞活力及IC50。細(xì)胞活力（%）=［D（λ）實(shí)驗(yàn)組-D（λ）調(diào)零組］/［D（λ）對照組-D（λ）調(diào)零組］×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.3 克隆集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力

取對數(shù)生長期SW1463細(xì)胞，接種于96孔板，設(shè)對照組、DMBG組、單純照射組、DMBG+照射組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，DMBG取 10 mmol/L（約 20%IC50濃度），對照組用等量PBS液處理，藥物作用24 h后，照射組與 DMBG+照射組分別給予 0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy劑量照射，將各組細(xì)胞鋪板于60 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，2周后甲醇固定，結(jié)晶紫染色，鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率，根據(jù)細(xì)胞克隆形成率計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%，細(xì)胞存活率=各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成率/對照組細(xì)胞克隆形成率，繪制細(xì)胞存活曲線。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期SW1463細(xì)胞，按上述“1.3”分組方法，參照文獻(xiàn)［8］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，照射組、DMBG+照射組的照射劑量取4 Gy（照射組細(xì)胞凋亡率約為20%的照射劑量），培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測對照組、DMBG組、照射組、DMBG+照射組細(xì)胞周期，加Amiexin-V-FITC/PI標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，具體操作步驟按試劑盒說明書要求進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 免疫印跡法檢測γ-H2AX、DNA-PK蛋白的表達(dá)

分組方法同上述“1.3”，將SW1463細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對照組與DMBG組不照射，照射組、DMBG+照射組用4 Gy劑量照射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照Trevigen公司試劑盒說明書要求和步驟進(jìn)行操作，利用北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司的凝膠成像系統(tǒng)測定目的蛋白條帶凈灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin的蛋白條帶灰度值比值確定目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 建立裸鼠移植瘤模型

取對數(shù)生長期SW1463細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后吹打成細(xì)胞懸液，用PBS液洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次，棄上清液，加PBS液將離心后沉淀的SW1463細(xì)胞稀釋至1.5×107/mL。取上述稀釋好的SW1463細(xì)胞0.2 mL注射于裸鼠上腹部皮下，1周后觀察，共有48只裸鼠造模成功，瘤體大小約為10 mm×10 mm。

1.7 荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線及抑瘤率檢測

將建模成功的48只裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組12只：對照組給予質(zhì)量濃度為0.9%的NaCl注射液；DMBG組注射DMBG；照射組給予質(zhì)量濃度為質(zhì)量濃度為0.9%的的NaCl注射液并照射；DMBG+照射組注射DMBG并照射，藥物作用2周，DMBG用質(zhì)量濃度為0.9%的NaCl注射液溶解，濃度為100mg/mL，DMBG組及DMBG+照射組每只裸鼠每天腹腔注射50 μL DMBG，對照組及照射組僅給予等量質(zhì)量濃度為0.9%的NaCl注射液進(jìn)行腹腔注射，照射組及DMBG+照射組進(jìn)行一次性照射，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參照文獻(xiàn)［8］，照射劑量為6 Gy。每周用游標(biāo)卡尺測量每只裸鼠瘤體的長徑（a）和短徑（b），計(jì)算腫瘤體積（V=0.52×a×b2），根據(jù)腫瘤體積變化繪制腫瘤生長曲線，至6周時(shí)用異氟烷過量麻醉法處死裸鼠，完整取出瘤體并稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對SW1463細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，作用48 h后，IC50為51.20 mmol/L，對照組和 5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L DMBG 組的細(xì)胞活力分別為（92.31±7.25）%、（87.93±10.02）%、（78.56±9.32）%、（67.63±11.17）%、（54.39±8.41）%、（21.95±6.38）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=43.283，P=0.021），5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L DMBG 組分別與對照組比較，細(xì)胞活力均顯著降低（t=2.486，3.741，6.023，8.375，11.247；P=0.039，0.031，0.007，0.005，0.002）。

2.2 二甲雙胍聯(lián)合放療對SW1463細(xì)胞存活率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy 照射，DMBG組、照射組和DMBG+照射組的細(xì)胞存活率組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DMBG+照射組分別與DMBG組及照射組比較，細(xì)胞克隆形成能力明顯下降，細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），見表1、圖 1。

表1 不同處理組SW1463細(xì)胞的存活率（n=5,%）Tab.1 Survival rate of SW1463 cells in different treatment group（n=5,%）

圖1 SW1463細(xì)胞的存活曲線Fig.1 Survival curves of SW1463 cells

2.3 二甲雙胍聯(lián)合放療對SW1463細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為（3.82±3.03）%，DMBG組細(xì)胞凋亡率為（16.19±4.38）%，照射組細(xì)胞凋亡率為（17.24±5.17）%，DMBG+照射組細(xì)胞凋亡率為（63.32±6.15）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.432，P=0.032）；DMBG+照射組分別與DMBG組及照射組比較，細(xì)胞凋亡率明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.287，9.074；P=0.037，0.031），見圖2。

圖2 DMBG聯(lián)合放療對SW1463細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of DMBG combined with radiotherapy on apoptosis of SW1463 cells

2.4 二甲雙胍聯(lián)合放療對SW1463細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，DMBG+照射組G0/G1期細(xì)胞比例減少，S期變化不大，G2/M期細(xì)胞比例增加，與DMBG組及照射組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明DMBG聯(lián)合放療后可促使SW1463細(xì)胞周期向放療敏感的G2/M偏移，見表2。

表2 DMBG聯(lián)合放療對SW14631細(xì)胞周期的影響（n=5）Tab.2 Effect of DMBG combined with radiotherapy on SW14631 cells cycle（n=5，%）

2.5 二甲雙胍聯(lián)合放療對γ-H2AX、DNA-PK蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，與DMBG組及照射組比較，DMBG+照射組可上調(diào)DNA損傷蛋白γ-H2AX蛋白的表達(dá)，下調(diào)DNA損傷修復(fù)蛋白DNA-PK蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。見表 3、圖 3。

表3 DMBG聯(lián)合放療對γ-H2AX及DNA-PK蛋白表達(dá)的影響（n=5）Tab.3 Effect of DMBG combined with radiotherapy on the expression of γ-H2AX and DNA-PK protein（n=5）

圖3 DMBG聯(lián)合放療對γ-H2AX、DNA-PK蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of DMBG combined with radiotherapy on the expression of γ-H2AX and DNA-PK proteins

2.6 二甲雙胍聯(lián)合放療對裸鼠移植瘤生長的影響

用藥6周后，完整取出實(shí)驗(yàn)組和對照組裸鼠瘤體稱重并計(jì)算抑瘤率，結(jié)果顯示，DMBG組、照射組和DMBG+照射組抑瘤率分別為（20.74±2.61）%、（31.52±3.43）%和（68.51±2.58）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=93.275，P=0.037），且 DMBG+照射組抑瘤率明顯高于DMBG組及照射組（P＜0.05）。DMBG+照射組裸鼠移植瘤體積和移植瘤重量均明顯變小，與照射組及DMBG組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 4、圖 4。

表4 DMBG聯(lián)合放療對裸鼠移植瘤生長的影響（n=12）Tab.4 Effect of DMBG combined with radiotherapy on the growth of transplanted tumor in nude mice（n=12）

圖4 裸鼠移植瘤的生長曲線Fig.4 Growth curves of transplanted tumor in nude mice

3 討論

直腸癌近年發(fā)病率呈上升趨勢，放療為其重要的治療手段，提高患者對放療的敏感性對預(yù)后有重要影響。二甲雙胍作為一種降糖藥物用于臨床治療2型糖尿病已有50多年歷史，2005年EVANS等［9］通過對蘇格蘭地區(qū)31萬人的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與使用其他藥物治療的2型糖尿病患者相比，使用二甲雙胍治療的2型糖尿病患者癌癥發(fā)病率下降23%，此后二甲雙胍的抗腫瘤作用引起了研究者的重視，目前已經(jīng)證實(shí)，二甲雙胍對乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤具有不同程度的抗癌作用［10-11］。潘永紅等［12］報(bào)道，二甲雙胍可增強(qiáng)吉非替尼對體外培養(yǎng)的EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞的抗癌效果。蔣超等［13］研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對肺癌A549細(xì)胞具有放療增敏作用。劉江偉等［14］亦報(bào)道，二甲雙胍對BxPC-3和AsPC-1兩種胰腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤具有放療增敏作用。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的直腸癌SW1463細(xì)胞及其裸鼠移植瘤為研究對象，從體內(nèi)外兩個(gè)方面觀察二甲雙胍對直腸癌細(xì)胞的放療增敏作用，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍單獨(dú)作用后可抑制SW1463細(xì)胞活力，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用隨之增強(qiáng)；聯(lián)合放療后亦降低了SW1463細(xì)胞的克隆形成能力及細(xì)胞存活率，提高了細(xì)胞凋亡率，同時(shí)建立裸鼠模型進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)裸鼠移植瘤的體積和重量與DMBG組及照射組相比亦明顯變小和減輕，抑瘤率明顯提高，證實(shí)二甲雙胍對直腸癌細(xì)胞具有放療增敏作用。

放療作用的核心是利用射線殺死或破壞癌細(xì)胞，抑制其生長、繁殖和擴(kuò)散，癌細(xì)胞對射線越敏感，放療效果越好。研究表明癌細(xì)胞群的細(xì)胞常處于不同的細(xì)胞增殖周期中，對射線敏感性也不一致，最敏感的是M期細(xì)胞，G2期細(xì)胞對射線的敏感性接近M期，S期細(xì)胞對射線敏感性最差，G1期次之［15］。本實(shí)驗(yàn)檢測SW1463細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍聯(lián)合放療后細(xì)胞周期分布發(fā)生變化，G2/M期細(xì)胞比例明顯增加，而G0/G1期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞周期明顯向?qū)Ψ暖熋舾械腉2/M期偏移，說明二甲雙胍聯(lián)合放療改變了癌細(xì)胞周期分布。射線對癌細(xì)胞可以造成損傷，但癌細(xì)胞也可通過自身修復(fù)機(jī)制修復(fù)這些損傷從而產(chǎn)生放療抵抗，γ-H2AX是細(xì)胞DNA損傷斷裂后形成的磷酸化染色質(zhì)核小體組蛋白，是細(xì)胞DNA損傷的標(biāo)志［16］。DNA-PK是DNA依賴性蛋白激酶，是基因組DNA損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵蛋白激酶，參與并決定著非同源末端連接DNA損傷修復(fù)通路的整個(gè)過程［17］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步應(yīng)用免疫印跡法檢測SW1463細(xì)胞γ-H2AX及DNA-PK蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相較單獨(dú)二甲雙胍或放療作用，二甲雙胍聯(lián)合放療后γ-H2AX蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而DNA-PK蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，提示二甲雙胍聯(lián)合放療可抑制SW1463細(xì)胞DNA損傷的自我修復(fù)能力。

綜上，本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)外初步證實(shí)二甲雙胍對直腸癌細(xì)胞具有放療增敏作用，其作用機(jī)制可能是二甲雙胍聯(lián)合放療改變了腫瘤細(xì)胞周期分布，抑制了腫瘤細(xì)胞DNA放療損傷后的自我修復(fù)能力。