E2F1基因過表達(dá)對人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株HCT116/L多藥耐藥性的影響

嚴(yán)林海 金欽文 覃宇周 陳建思 鐘華戈 唐衛(wèi)中

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科

結(jié)腸癌是我國常見的惡性腫瘤，具有易突變耐藥的特征［1］，開展結(jié)腸癌多藥耐藥及其逆轉(zhuǎn)的研究成為目前該領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。E2F1是細(xì)胞周期相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子E2F家族成員之一，在細(xì)胞周期進(jìn)展過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，E2F1可促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖而誘發(fā)腫瘤，起促癌基因作用［2-3］。研究報(bào)道E2F1可以調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，從而影響E2F1基因?qū)谏亓瞿退幮缘恼{(diào)控［4］，但是E2F1過表達(dá)對結(jié)腸癌耐藥的影響至今尚未完全清楚。本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒介導(dǎo)E2F1基因過表達(dá)，觀察其對結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的影響并探討可能的作用機(jī)制，為提高結(jié)腸癌臨床靶向化療療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株HCT116/L購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海生命科學(xué)研究院，細(xì)胞認(rèn)證編號：MXC469），E2F1過表達(dá)重組慢病毒載體（pCMAE2F1-HA）及其陰性對照慢病毒載體（pCMA-HA）由廣西結(jié)直腸癌診療中心實(shí)驗(yàn)室保存［5］。流式細(xì)胞儀BD FACSCalibur購自美國BD公司，E2F1、MDR1和GAPDH一抗購自美國Abcam公司，二抗購自美國Santa Cruz公司，倒置熒光顯微鏡（TE2000）購自日本尼康公司。

1.2 細(xì)胞分組

人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑HCT116/L細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清及 600 ng/mL順鉑（DDP）的1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組，HCT116/L+E2F1組和HCT116/L+NC組分別用E2F1過表達(dá)重組慢病毒載體（pCMAE2F1-HA）及其陰性對照慢病毒載體（pCMA-HA）轉(zhuǎn)染，采用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的熒光效果。

1.3 Western blot檢測E2F1及耐藥相關(guān)基因MDR1的蛋白表達(dá)

HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組分別加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，10 000～14 000 g，4℃離心10 min后，上層液體即為蛋白裂解液。各組取等量蛋白變性后經(jīng)10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，用各目的蛋白特異性一抗（E2F1、MDR1、GAPDH，稀釋濃度為1∶1 000）室溫孵育 2 h，TBST 漂洗3 次，加相應(yīng)二抗（稀釋濃度為 1∶1 500），室溫孵育 1 h，TBST 漂洗 3 次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，對條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。GAPDH作為內(nèi)參照。目的蛋白表達(dá)水平以各目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照灰度值的比值表示。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞半數(shù)凋亡濃度

取對數(shù)生長期細(xì)胞，按照每孔1×106個(gè)細(xì)胞鋪板，待孔中細(xì)胞融合度達(dá)70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染成功后，按照各種藥物的血漿高峰濃度設(shè)置4個(gè)濃度梯度（阿霉素：0.004 μg/mL、0.04 μg/mL、0.4 μg/mL、4 μg/mL；5-FU：0.02 μg/mL、0.2 μg/mL、2 μg/mL、20 μg/mL；順鉑：0.006 μg/mL、0.06 μg/mL、0.6 μg/mL、6 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。各孔加入20 μL MTT（濃度為5 g/L），培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μL，室溫振蕩15 min。使用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔的吸光光度值（OD），取6個(gè)復(fù)孔的平均數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD450-陰性對照組OD450）/（陰性對照組OD50-正常對照組OD450）×100%，應(yīng)用Nosa軟件計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)凋亡濃度（IC50）。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)阿霉素的泵出率

取對數(shù)生長期細(xì)胞，按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞鋪板，轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后每孔加入阿霉素濃度為3 mg/L的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。用放置在4℃冰箱的PBS洗滌細(xì)胞2次，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)的阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，接收波長575 nm。細(xì)胞內(nèi)阿霉素的泵出率=（阿霉素的蓄積量-阿霉素的潴留量）/阿霉素的蓄積量×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況

取對數(shù)生長期細(xì)胞重懸，將HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6孔板，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃孵育48 h后，采用7AAD-PE染色標(biāo)記（Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒用紅色熒光染料PE）檢測癌細(xì)胞凋亡，消化各組細(xì)胞，收集于EP管中，PBS洗滌，離心收集細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

取對數(shù)生長期細(xì)胞重懸，將HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，37℃孵育24 h，用20 μL移液器槍頭于培養(yǎng)板底部劃“一”字痕，PBS沖洗3遍，徹底洗脫懸浮細(xì)胞。然后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每孔加入10 μM相同濃度的無血清順鉑。分別于培養(yǎng)至0 h、24 h、48 h時(shí)用倒置顯微鏡拍攝劃痕邊緣進(jìn)展情況，應(yīng)用NIH圖像處理軟件分析細(xì)胞遷移程度。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期細(xì)胞重懸，將HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6孔板，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃孵育48 h后，消化各組貼壁細(xì)胞，收集于EP管中，用預(yù)冷PBS吹勻，再以1 500 r/min離心15 min，棄上清液，加入4℃已預(yù)冷75%乙醇3 mL，固定30 min，再次離心后將細(xì)胞重懸于含100 mg/L RNA酶和10 mg/L碘化丙錠的PBS中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行單色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，用Multiplus softwareⅡ軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染結(jié)果

pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體和pCMA-NC-HA陰性對照慢病毒載體轉(zhuǎn)染HCT116/L細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察，可見較多細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，HCT116/L+NC組和HCT116/L+E2F1組轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%以上，且兩組轉(zhuǎn)染效率無明顯差異（圖1），說明pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體成功感染HCT116/L細(xì)胞。HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組中的E2F1蛋白表達(dá)量分別為2.62±0.59、0.37±0.09和 0.22±0.05，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=385.124，P＜0.05），進(jìn)一步兩兩比較，HCT116/L+E2F1 組 E2F1 蛋白表達(dá)水平明顯高于HCT116/L+NC組和HCT116/L組（P＜0.05）（圖 2）。

2.2 過表達(dá)E2F1對化療藥物敏感性的影響

MTT法分別檢測3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對阿霉素、5-FU和順鉑的IC50值（圖3），HCT116/L+E2F1組對阿霉素、5-FU和順鉑的 IC50值分別為（1.61±0.21）μg/mL、（5.22±0.12）μg/mL、（3.52±0.15）μg/mL，HCT116/L+NC組分別為（0.61±0.11）μg/mL、（3.93±0.54）μg/mL、（2.31±0.45）μg/mL，HCT116/L 組分別為（0.69±0.13）μg/mL、（4.19±0.51）μg/mL、（2.51±0.42）μg/mL，阿霉素、5-FU和順鉑的IC50值3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.971、9.051、16.173，P＜0.05），且 HCT116/L+E2F1 組 IC50值高于 HCT116/L+NC 組和HCT116/L組（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體后，HCT116/L細(xì)胞對化療藥物（阿霉素、5-FU和順鉑）的敏感性降低。

2.3 過表達(dá)E2F1對HCT116/L細(xì)胞內(nèi)阿霉素泵出率的影響

轉(zhuǎn)染重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA 72 h后，流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞中阿霉素的泵出率（圖4），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組阿霉素的泵出率分別為（22.51±0.12）%、（10.92±0.09）%和（8.45±0.11）%，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.513，P＜0.05），且 HCT116/L+E2F1 組高于 HCT116/L+NC組和HCT116/L組（P＜0.05）。

圖1 pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染HCT116/L細(xì)胞的結(jié)果（×200）Fig.1 Transfection results of pCMA-E2F1-HA recombinant lentiviral plasmid vector（×200）

圖2 不同處理組HCT116/L細(xì)胞中E2F1蛋白的表達(dá)水平Fig.2 The expression level of E2F1 protein in HCT116/L cells of various treatment groups

圖3 不同處理組HCT116/L細(xì)胞對化療藥物的敏感性Fig.3 Sensitivity of anti-tumor drugs in HCT116/L cells of various treatment groups

圖4 不同處理組HCT116/L細(xì)胞阿霉素的泵出率Fig.4 Pumping rate of Adriamycin in HCT116/L cells of various treatment groups

2.4 過表達(dá)E2F1對HCT116/L細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA 72 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率（圖5），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組的細(xì)胞凋亡率分別為（6.42±0.52）%、（12.81±0.69）%和（11.45±0.31）%，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.682，P＜0.05），且HCT116/L+E2F1組細(xì)胞凋亡率低于HCT116/L+NC組和HCT116/L組（P＜0.05）。

圖5 不同處理組HCT116/L細(xì)胞的凋亡率Fig.5 Apoptosis rate of HCT116/L cells in various treatment groups

2.5 過表達(dá)E2F1對HCT116/L細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA 72 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期（圖6），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組S期（DNA合成期）細(xì)胞比例分別為（42.37±2.13）%、（27.54±3.69）%和（22.02±3.28）%，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=109.6，P＜0.05），且 HCT116/L+E2F1 組明顯高于 HCT116/L+NC 組和 HCT116/L組（P＜0.05），說明 HCT116/L+NC組和HCT116/L組有較少的細(xì)胞處于分裂期，而pCMAE2F1-HA對細(xì)胞進(jìn)入S期的促進(jìn)作用較強(qiáng)。

圖6 不同處理組HCT116/L細(xì)胞S期的比例Fig.6 Proportion of S phase in HCT116/L cells of various treatment groups

2.6 過表達(dá)E2F1對HCT116/L細(xì)胞遷移能力的影響

重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA轉(zhuǎn)染成功后，倒置顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞遷移（圖7），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組細(xì)胞愈合面積比分別為（48.29±5.21）%、（36.11±4.56）%和（35.73±5.17）%，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.232，P＜0.05），且 HCT116/L+E2F1 組明顯高于 HCT116/L+NC 組和 HCT116/L組（P＜0.05），說明 HCT116/L+NC組和HCT116/L組細(xì)胞遷移能力較pCMA-E2F1-HA轉(zhuǎn)染后的HCT116/L+E2F1組弱。

2.7 過表達(dá)E2F1對HCT116/L細(xì)胞中MDR1蛋白表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA 72 h后，檢測3組細(xì)胞MDR1蛋白的表達(dá)（圖8），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組中MDR1蛋白表達(dá)量分別為（0.41±0.08）%、（0.19±0.08）%和（0.15±0.07）%，3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.180，P＜0.05），且HCT116/L+E2F1組高于HCT116/L+NC組和HCT116/L組（P＜0.05）。

圖7 不同處理組HCT116/L細(xì)胞的遷移能力（×5）Fig.7 Migration ability of HCT116/L cells in various treatment groups（×5）

圖8 不同處理組HCT116/L細(xì)胞MDR1蛋白的表達(dá)量Fig.8 Expression of MDR1 protein in HCT116/L cells of various treatment groups

3 討論

細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F1是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子［6］，作為重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，其與pRb共同參與調(diào)控細(xì)胞由G0/G1期向S期過渡。E2F1不僅參與細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化，還通過一種依賴E2F家族的自身反饋調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活動，E2F1可以誘導(dǎo)并激活miR-20a（miR-17-92簇中的一員），有抗細(xì)胞凋亡的作用，而miR-20a則能抑制E2F1 mRNA的翻譯［7］。更重要的是，有研究顯示，E2F1基因可以通過p73/DNp73-miR-205這一作用軸調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，從而影響細(xì)胞的耐藥性［4］，以上證據(jù)提示E2F1基因與腫瘤多藥耐藥性密切相關(guān)，但是E2F1對結(jié)腸癌耐藥的影響尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)成功利用重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株HCT116/L并使E2F1穩(wěn)定過表達(dá)，采用MTT、流式細(xì)胞儀等技術(shù)觀察E2F1基因過表達(dá)后對HCT116/L細(xì)胞耐藥性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)E2F1基因后，細(xì)胞對化療藥物順鉑、阿霉素、5-FU的敏感性顯著降低，細(xì)胞內(nèi)阿霉素的泵出率明顯升高，說明E2F1基因過表達(dá)可增強(qiáng)結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞HCT116/L的耐藥性。

MDR基因在人類中有2種：MDR1和MDR2，其中MDR1與腫瘤多藥耐藥有關(guān)，MDR2的功能尚不清楚，但MDR1和MDR2基因序列具有較高的同源性。人類MDR1基因位于第7號染色體長臂上，含有28個(gè)外顯子，內(nèi)含子與外顯子交界符合經(jīng)典的APG配對，全長為4.5 kb。MDR1基因含有一個(gè)開放讀框，編碼1 280個(gè)氨基酸多肽，經(jīng)糖基化后形成170 kU的P-gp。P-gp屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一，由2個(gè)同源部分組成，每部分都包含6個(gè)疏水跨膜區(qū)和1個(gè)具有高度保守ATP結(jié)合位點(diǎn)的親水區(qū)，親水區(qū)可能含有2個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，而疏水區(qū)則含有多個(gè)與MDR有關(guān)的藥物結(jié)合位點(diǎn)［8］。P-gp還具有能量依賴性“藥泵”功能，可將細(xì)胞內(nèi)帶陽性電荷的親脂類化療藥物逆濃度泵至細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)的化療藥物達(dá)不到有效作用濃度而產(chǎn)生耐藥性。這種由P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥稱為典型多藥耐藥。目前認(rèn)為P-gp作用機(jī)制是：當(dāng)抗癌藥進(jìn)入胞漿膜，被識別并外排，當(dāng)具有疏水結(jié)構(gòu)域的抗癌藥物彌散通過胞漿膜時(shí)，遇到兩側(cè)擴(kuò)散而來的多藥耐藥運(yùn)載體，運(yùn)載體利用2個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)上的能量將藥物泵出細(xì)胞外，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿中產(chǎn)生的疏水代謝產(chǎn)物則作為轉(zhuǎn)運(yùn)體的潛存底物，且這條通路不止一條。化療及其他藥物單一的長期治療激活了P-gp的功能，使藥物在細(xì)胞內(nèi)積蓄減少，從而產(chǎn)生了腫瘤的多藥耐藥［9］。有研究表明［10］，MDR1為腫瘤細(xì)胞耐藥的直接相關(guān)基因，MDR1調(diào)控耐藥的機(jī)制可能是：⑴當(dāng)MDR1下調(diào)時(shí)P-gp生成減少，藥物逆濃度泵出減少，使細(xì)胞內(nèi)的化療藥物有效濃度提高，從而對細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用［11］；⑵MDR1表達(dá)下調(diào)可使外源性化學(xué)毒物穿過胃腸道黏膜和促進(jìn)人體腸道上皮細(xì)胞吸收化療藥物，從而使體內(nèi)細(xì)胞吸收的化療藥物增多［12］。研究［13］還顯示，正常細(xì)胞在氧氣充足時(shí)獲得能量是通過氧化磷酸化，極少數(shù)缺氧情況下細(xì)胞通過糖酵解獲得能量，但腫瘤細(xì)胞均通過糖酵解獲得能量。這種從正常細(xì)胞到腫瘤細(xì)胞獲取能量方式的切換，稱為代謝重編程，也認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生癌變最重要的特征之一。NADPH氧化酶（NOX4）可促使細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS），一般認(rèn)為細(xì)胞中ROS的積累會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)由NOX4介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS不僅不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡還會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。NOX4介導(dǎo)的ROS是將腫瘤耐藥和腫瘤細(xì)胞代謝重編程結(jié)合的過程。NOX4定位于線粒體內(nèi)膜中，而線粒體中ATP在亞細(xì)胞水平上的重分配扮演變構(gòu)開關(guān)角色，可活化NOX4。NOX4產(chǎn)生的ROS可抑制PCAF依賴的乙?；蚉KM2溶酶體降解，這個(gè)過程同時(shí)伴有MDR1激活［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，E2F1過表達(dá)可抑制人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞HCT116/L細(xì)胞凋亡和增加阿霉素的泵出率，上調(diào)MDR1蛋白表達(dá)，增加P-gp蛋白產(chǎn)生，抑制細(xì)胞吸收化療藥物，從而降低細(xì)胞的化療敏感性，而E2F1基因可能同時(shí)參與了腫瘤耐藥和腫瘤細(xì)胞代謝重編程結(jié)合的過程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)E2F1可降低人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞HCT116/L對化療藥物的敏感性，上調(diào)MDR1蛋白表達(dá)，減少化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積濃度，增強(qiáng)細(xì)胞的多藥耐藥性，E2F1基因在結(jié)腸癌多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)中可能扮演重要角色。本研究僅是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，未進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，且缺乏大規(guī)模的臨床樣本輔證，今后將補(bǔ)充上述實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察E2F1基因過表達(dá)后結(jié)腸癌細(xì)胞多藥耐藥性對其他信號通路的影響，更深入和全面地探討其可能的作用機(jī)制。