心肌爾康對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠的降壓作用和對(duì)靶器官損傷的影響

王麗，丁玲，胡娟，胡正帥，高杉

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥　230032)

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心肌爾康對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠的降壓作用和對(duì)靶器官損傷的影響

王麗，丁玲，胡娟，胡正帥，高杉

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥230032)

目的探討心肌爾康對(duì)一氧化氮合酶抑制劑L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠心血管重構(gòu)的影響。方法實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、心肌爾康組。每周測(cè)小鼠尾動(dòng)脈壓，實(shí)驗(yàn)第8周末，處死小鼠，計(jì)算小鼠心臟指數(shù)、肺重指數(shù)，HE染色和V-G染色觀察心臟、胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)改變。測(cè)定小鼠血漿NO含量。結(jié)果與正常組相比，模型組血壓明顯升高(P<0.01) ，心臟指數(shù)、心肌細(xì)胞橫截面積、心肌纖維化明顯升高，胸主動(dòng)脈發(fā)生明顯重構(gòu)。血漿NO含量降低；與模型組相比，心肌爾康能明顯降低L-NAME誘導(dǎo)的高血壓小鼠的血壓(P<0.01)，升高NO含量，改善心血管重構(gòu)。結(jié)論心肌爾康能明顯抑制L-NAME誘導(dǎo)小鼠血壓的升高，改善心血管重構(gòu)。

高血壓;一氧化氮合酶;中草藥;治療結(jié)果;小鼠

高血壓是臨床的常見病、多發(fā)病，是嚴(yán)重危害人民群眾健康的重大公共安全事件，常導(dǎo)致心、肺、腎等靶器官損害。心血管作為最重要的高血壓靶器官，其損傷主要表現(xiàn)為心血管重構(gòu)，如心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化、心室肥厚等。一氧化氮(NO)是人體內(nèi)一個(gè)重要的氣體信號(hào)分子，參與多種生理活動(dòng)，對(duì)機(jī)體心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)的維持起著重要作用。病理情況下NO合成釋放減少，將導(dǎo)致一系列心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，如高血壓、冠心病等[1]。文獻(xiàn)報(bào)道[2],一氧化氮合酶催化L-精氨酸合成NO，而競(jìng)爭(zhēng)性NO合酶抑制劑L-NAME，可抑制NO的合成和釋放，進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血壓進(jìn)行性升高，是一種常用的高血壓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[3]。心肌爾康是安徽中醫(yī)藥大學(xué)名老中醫(yī)王樂陶教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的臨床驗(yàn)方，由人參、黃芪、麥冬、玉竹等十四種中藥材組成，具有滋陰養(yǎng)心，活血養(yǎng)血。臨床和基礎(chǔ)研究均表明該方對(duì)心臟有保護(hù)作用，如對(duì)冠心病、病毒性心肌炎有明顯療效[4-5]。本研究通過建立L-NAME誘導(dǎo)的高血壓動(dòng)物模型，觀察心肌爾康的實(shí)驗(yàn)治療作用，為心肌爾康的臨床應(yīng)用、揭示其作用機(jī)制提供進(jìn)一步的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物模型制備和分組清潔級(jí)雄性昆明小鼠30只，體重18～23 g，隨機(jī)分為3組，每組10只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組分別死亡若干只，所以每組最終的樣本量有所差別。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]和前期實(shí)驗(yàn)條件摸索復(fù)制L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠模型，正常組接受普通飲食飲水，模型組和心肌爾康組中加入L-NAME(2 g·L-1)，連續(xù)給藥8周，心肌爾康組自第5周起每天灌胃給予心肌爾康12 g·kg-1，每天1次，連續(xù)4周。

1.2藥物及儀器心肌爾康水提浸膏干粉由合肥七星醫(yī)藥科技有限公司所制備。NO試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)：20150119；JA123電子天平購(gòu)自上海精天電子儀器有限公司；TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ALC-NIBP無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)，上海奧爾科特生物科技有限公司。

1.3測(cè)量指標(biāo)

1.3.1動(dòng)態(tài)血壓測(cè)量

采用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈測(cè)壓法檢測(cè)小鼠清醒狀態(tài)下的尾動(dòng)脈收縮壓，每周1次，每只小鼠測(cè)量7～8次，取平均值作為當(dāng)周小鼠的收縮壓。

1.3.2心重指數(shù)、肺重指數(shù)的測(cè)定

8周稱重，10%水合氯醛(0.05 mL·10 g-1)腹腔注射麻醉。頸動(dòng)脈插管取血。取完血后，迅速打開胸腔取出心臟、肺、胸主動(dòng)脈。剝離心臟周圍胸腺和結(jié)締組織，濾紙吸干后稱量心臟重量(Heart weight,HW)，計(jì)算心臟指數(shù)(HW/BW)；肺同上，計(jì)算肺重指數(shù)(LW/BW)。

1.3.3心臟病理學(xué)觀察

10%福爾馬林溶液灌流心臟15 min、 固定，然后脫水、包埋，制成蠟塊，4 μm連續(xù)切片，切片在60℃烘箱中脫蠟，行HE和V-G染色，樹脂封片。借助Nikon Eclipse 80i進(jìn)行圖像采集，根據(jù)我們之前報(bào)道的方法[8-9]，ImageJ1.61計(jì)算心肌細(xì)胞橫截面積(CSA)、心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)和血管周膠原容積分?jǐn)?shù)(PVCA)。其中，PVCA=血管周圍膠原面積/血管及管腔總面積，CVF=心肌間質(zhì)膠原面積/心肌間質(zhì)總面積。

1.3.4胸主動(dòng)脈病理學(xué)觀察

剝離胸主動(dòng)脈與周圍的結(jié)締組織，10%福爾馬林溶液固定、脫水、包埋、制蠟、切片,同心臟染色方法。顯微鏡觀察采集圖片，借助軟件ImageJ1.61分析計(jì)算血管總面積(TAA)、管腔面積(LA)、血管外徑(AD)、血管內(nèi)徑(LD)、中膜厚度(MT)。

1.3.5血漿中一氧化氮(nitric oxide，NO)含量的測(cè)定

2　結(jié)果

2.1心肌爾康對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠血壓的影響如圖1所示，三組小鼠初始血壓值各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，給L-NAME后，與正常組相比，模型組小鼠血壓明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，4周后，血壓上升平緩；從第五周起經(jīng)心肌爾康藥物治療4周后，與模型組相比，心肌爾康組小鼠血壓明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：與對(duì)照組相比，aP <0.01；與模型組相比，bP<0.01 。

2.2心肌爾康對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠心臟重量指數(shù)(HW/BW)、肺重指數(shù)(LW/BW)的影響與正常組相比，模型組HW/BW明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)心肌爾康治療后，與模型組相比，心肌爾康可明顯抑制HW/BW的升高，抑制心肌肥厚，改善心室重構(gòu)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各組之間LW/BW比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.3心肌爾康對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠心肌肥大及纖維化的影響HE染色和V-G染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組CSA明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)心肌爾康治療后，能明顯降低模型組CSA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。V-G染色后，心肌組織呈黃色，膠原纖維顯紅色。與正常組相比，模型組膠原纖維明顯增多，CVF、PVCA明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，心肌爾康組纖維化程度降低，CVF、PVCA明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2及圖3。

表1　心肌爾康對(duì)L-NAME高血壓小鼠BW,HW,LW,HW/BW,LW/BW的影響

注：與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01 。

注：A：心肌細(xì)胞橫截面積代表圖(HE×400)；B：心肌細(xì)胞縱徑代表圖(HE×400)；C：心肌細(xì)胞橫截面積(CSA)統(tǒng)計(jì)圖。1：正常組；2：模型組：3：心肌爾康組。與正常組相比，aP <0.01 ；與模型組相比，bP<0.01 。

2.4心肌爾康對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠主動(dòng)脈環(huán)重構(gòu)的影響如表2，圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠主動(dòng)脈的TAA、CSA均明顯增加，表明L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠主動(dòng)脈發(fā)生明顯重構(gòu)(P<0.01、P<0.05)；經(jīng)心肌爾康治療后，TAA、CSA均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示心肌爾康可明顯改善主動(dòng)脈重構(gòu)。

2.5心肌爾康對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓小鼠血漿NO含量的影響圖5結(jié)果顯示，與正常組相比模型組小鼠血漿NO含量較正常組明顯降低(P<0.01)，給予心肌爾康實(shí)驗(yàn)治療后，心肌爾康可明顯抑制血漿中NO含量的降低(P<0.05)。

注：A：心肌間質(zhì)膠原VG染色代表圖(×400)；B：心肌血管周圍膠原VG染色代表圖(×400)；C：心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)；D：心肌血管周膠原容積分?jǐn)?shù)(PVCA) 。1：正常組；2：模型組；3：心肌爾康組。與正常組相比，aP<0.01 ；與模型組相比，bP<0.01。

注：1：正常組；2：模型組；3：心肌爾康組。

注：1：正常組；2：模型組；3：心肌爾康組。與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05。

表2　心肌爾康對(duì)L-NAME高血壓小鼠主動(dòng)脈重構(gòu)的影響±s)

注：TAA：動(dòng)脈總面積；LA：動(dòng)脈內(nèi)管腔面積；CSA：動(dòng)脈橫段面積；AR：動(dòng)脈外管腔半徑;Media：中膜厚度。與對(duì)照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05。

3　討論

內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋于脈管系統(tǒng)內(nèi)層的單層細(xì)胞，正常的內(nèi)皮細(xì)胞排列規(guī)則，能夠通過產(chǎn)生一系列的生物活性因子對(duì)血流切應(yīng)力、外界物理和化學(xué)信號(hào)產(chǎn)生響應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞不僅通過產(chǎn)生和釋放幾種血管活性分子舒張或收縮血管，還能對(duì)血管中的其它活性物質(zhì)如緩激肽和凝血酶產(chǎn)生應(yīng)答和修飾，共同參與血管張力的維持。

L-NAME是一種非選擇性的NOS抑制劑，長(zhǎng)期給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)-NAME后， 使內(nèi)皮依賴性NO生成、釋放減少[10]，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，影響其舒血管效應(yīng)從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血壓升高，是一種經(jīng)典的高血壓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[11]。有研究表明,經(jīng)L-NAME處理后，心肌中NO含量降低,AngⅡ的含量升高，表明心肌局部NO與AngⅡ含量的變化參與了高血壓及心室重構(gòu)的形成[12]。研究認(rèn)為[13]心臟局部組織中的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)參與了心室重構(gòu)過程。AngⅡ與NO具有相反的血管作用，在高血壓動(dòng)物模型中它們也存在相反的血管及細(xì)胞增殖反應(yīng)，如影響血管中膜厚度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等變化[14]。因此AngⅡ的升高除了收縮血管而導(dǎo)致血壓升高外，還可產(chǎn)生心臟血管重構(gòu)效應(yīng)，而長(zhǎng)期的心血管重構(gòu)是心腦血管終點(diǎn)事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水中加入NOS抑制劑，連續(xù)4周后即可形成穩(wěn)定的高血壓(P<0.01)，提示造模成功。心肌爾康是安徽中醫(yī)藥大學(xué)王樂陶教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)形成的一劑臨床驗(yàn)方，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心肌爾康能明顯降低模型組的血壓(P<0.01)，改善心血管重構(gòu)，其機(jī)制可能與提高血清中NO含量、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)初步揭示了心肌爾康對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的藥理學(xué)效應(yīng)和部分機(jī)制，而有關(guān)其量效關(guān)系和深入的分子機(jī)制本課題組正在進(jìn)一步研究中。

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Effect of Xinjierkang on anticardiovascular remodeling inL-NAME induced hypertension mice

WANG Li,DING Ling,HU Juan,et al

(DepartmentofPharmacology,BasicMedicalCollege,AnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230032,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Xinjierkang(XJEK) onL-NAME induced hypertension and cardiovascular remodeling in mice.MethodsMice were assigned into control group,model group,and Xinjierkang group,At the end of 8thweek,the mice were euthanatized and the heart,lung and thoracic aorta were harvested,The heart weight/body weight(HWI),lung weight/body weight(LWI) were calculated,respectively,HE staining and/or V-G staining were used to detect cardiac and thoracic aortic pathological changes,Colorimetric analysis was used to assay nitric oxide(NO) in plasma.ResultsCompared with control group,the systolic blood pressure,HWI,LWI,cross-sectional area of cardiomyocytes,myocardial fibrosis were significantly increased(P<0.01),as well as marked thoracic aortic remodeling,decreased plasma NO content,Administration with XJEK markedly inhibited the elevation of systolic blood pressure,HWI and LWI,which blunted the decrease of NO plasma content,ameliorated cardiovascular remodeling.ConclusionsXJEK has protective effects against cardiovascular remodeling inL-NAME induced hypertensive mice.

Hypertension;Nitric oxide synthase;Drugs,chinese herbal;Treatment outcome;Mice

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373774)

王麗，女，碩士研究生

高杉，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail:aydgs@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.007

2016-03-11，

2016-06-08)