HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地女貞子中紅景天苷、女貞苷、特女貞苷的含量

李彥靈，龔曼，曾凡一，位慧蕓，王夏影，閆福林*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)，是一味補(bǔ)腎滋陰、養(yǎng)肝明目的中藥，可用于肝腎不足、頭暈耳鳴、頭發(fā)早白及兩目昏糊等病癥[1]。主要化學(xué)成分有三萜類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、苯乙醇類(lèi)、黃酮類(lèi)、梓醇、醌類(lèi)、揮發(fā)油、脂肪酸、磷脂等成分[2-6]，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)女貞子具有抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、保肝、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等作用[7-9]。女貞子主要產(chǎn)于我國(guó)的河南、陜西、江蘇、長(zhǎng)江流域等地，在各地也有種植。當(dāng)前藥材市場(chǎng)上的女貞子存在以次充好的現(xiàn)象，危害大眾的健康，需要對(duì)女貞子藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，保障臨床用藥的安全性。因此本文應(yīng)用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地的女貞子藥材進(jìn)行指標(biāo)性成分的測(cè)定，為女貞子藥材的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，UV檢測(cè)器，F(xiàn)A2004電子F分析天平(批號(hào)：14D101-1000，上海良平儀器儀表有限公司)；HH恒溫水浴鍋(金壇市中大儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R206)(上海申生科技有限公司)；SHZ-3循環(huán)水式多用真空泵、CCA-420低溫冷卻水循環(huán)泵(鄭州杜普儀器廠)。

紅景天苷(批號(hào)：B20504)、女貞苷(批號(hào)：B20924)、特女貞苷(批號(hào)：B21240)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水。實(shí)驗(yàn)用女貞子樣品均由安徽普仁中藥飲片有些公司提供，經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院蘇慧慧鑒定為木犀科植物女貞的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Aglient Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相水-乙腈，梯度洗脫：0～2 min，5%乙腈；2～40 min，5%～30%乙腈；40～45 min，30%乙腈；45～50 min，30%～5%乙腈。體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取紅景天苷、女貞苷、特女貞苷對(duì)照品適量，使配成0.152 mg/mL、1.00 mg/mL、1.00 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，接取續(xù)濾液，備用。

2.2.2 供試品溶液的配制

精密稱(chēng)取過(guò)4號(hào)篩的女貞子粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入95%的甲醇溶液25.0 mL，稱(chēng)重，超聲30 min，室溫放置10 min，再稱(chēng)重，并用95%的甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量。靜置20 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，接取續(xù)濾液，即得。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液5、10、12.5、15、20 μL進(jìn)樣，記錄各濃度下的色譜峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。紅景天苷、女貞苷、特女貞苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍分別為：Y=21 899X-22 883，r=0.999，0.76～3.04 μg；Y=66 272X-24 395，r=0.999 1，5.00～20.00 μg；Y=93 479X+23 418，r=0.999 9，5.00～20.00 μg。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入高校液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，紅景天苷、女貞苷、特女貞苷色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于3 000，具體見(jiàn)圖1。

注:1.紅景天苷;2.女貞苷;3.特女貞苷?qǐng)D1 對(duì)照品(A)及女貞子樣品(B)HPLC圖

2.4.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各對(duì)照品色譜峰面積，紅景天苷、女貞苷、特女貞苷峰面積的RSD值分別為0.55%、0.48%、0.85%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取女貞子S6樣品共5份，按“2.2.2”項(xiàng)下平行制備5份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣，結(jié)果紅景天苷、女貞苷、特女貞苷峰面積的RSD值分別為1.02%、2.11%、0.98%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取女貞子S1樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜方法分別在0、1、2、4、6進(jìn)樣分析，記錄各對(duì)照品色譜峰面積，結(jié)果紅景天苷、女貞苷、特女貞苷峰面積的RSD值分別為2.51%、3.05%、2.11%，表明供試品在常溫條件下放置6 h穩(wěn)定性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知對(duì)照品含量的女貞子S2樣品5份，每份0.5 g，分別加入紅景天苷、女貞苷、特女貞苷對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各對(duì)照品色譜峰面積，計(jì)算回收率。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 樣品測(cè)定

取10批不同產(chǎn)地的女貞子藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2。

3 討論

建立符合中醫(yī)藥“整體性”作用特點(diǎn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，是當(dāng)前中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中迫切需要解決的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。中藥作用的整體性、組成成分的多樣性、作用靶點(diǎn)的復(fù)雜性、以及成分間相互作用的難以預(yù)測(cè)性，使得檢測(cè)單一活性成分的西藥質(zhì)控方法在中藥領(lǐng)域中行不通[10]。中藥作用的發(fā)揮是依靠多種成分的共同作用而實(shí)現(xiàn)的，這一觀點(diǎn)已經(jīng)成為共識(shí)，利用多種成分分析來(lái)控制中藥質(zhì)量已經(jīng)成為主流。隨著中藥用藥有效性、安全性問(wèn)題日益得到重視，建立高品質(zhì)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以保證藥材的質(zhì)量是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)[11-13]。

紅景天苷是具有苯乙醇結(jié)構(gòu)的苷類(lèi)成分，研究結(jié)果表明其具有保肝、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等多種藥理作用[14-15]。女貞苷、特女貞苷為裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分，是女貞子的特征成分[16-17]。崔蘊(yùn)慧等[18]對(duì)女貞子的指紋圖譜及紅景天苷、特女貞苷含量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)紅景天苷的含量在0.060%～0.294%，特女貞苷含量在0.473%～2.149%。參考楊光明等的方法[19]紅景天苷、女貞苷、特女貞苷分別在282 nm處有最大吸收，因此本文選用282 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紅景天苷、女貞苷、特女貞苷分別在進(jìn)樣量0.76～3.04 μg(r=0.999 9)、5.00～20.00 μg(r=0.999 1)、5.00～20.00 μg(r=0.999 9)范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，平均回收率分別為99.19%、100.27%、100.46%。10個(gè)產(chǎn)地女貞子藥材紅景天苷、女貞苷、特女貞苷含量分別在2.06～4.34 mg/g、2.52～28.73 mg/g、8.86～46.84 mg/g范圍。紅景天苷含量以河南平頂山產(chǎn)女貞子最高(4.34 mg/g)，女貞苷、特女貞苷含量以河南產(chǎn)為最高(28.73 mg/g、46.84 mg/g)。而安徽產(chǎn)女貞子紅景天苷、女貞苷、特女貞苷的含量均低，分別為2.27 mg/g、10.08 mg/g、14.21 mg/g。這與任爽、鄒小燕等[20-21]的研究相一致。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 不同產(chǎn)地女貞子中紅景天苷、女貞苷、特女貞苷含量測(cè)定結(jié)果

本方法用于女貞子藥材中紅景天苷、女貞苷、特女貞苷的含量測(cè)定具有簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高、便于操作、分離效果好的特點(diǎn)，因此所建立的高效液相測(cè)定方法可用于女貞子藥材的質(zhì)量控制研究。