水產(chǎn)動物主要致病弧菌多重PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

成翔宇 馮春明 馬紅麗 李 華 葉仕根

大連海洋大學(xué)/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗(yàn)室，遼寧大連116023

溶藻弧菌（V. alginolyticus）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus）是3 種常見的水產(chǎn)動物病原菌，3 種弧菌均可感染魚類、甲殼類、貝類等多種水產(chǎn)動物[1]，能引起魚類體表出血、皮膚潰瘍、腸炎以及對蝦的紅腿、腸炎等癥狀[2]。由于這3 種弧菌所引起的水產(chǎn)動物感染有諸多相似之處，難以通過癥狀確診，多重PCR 技術(shù)具有較高的特異性和靈敏度，而且可以同時(shí)檢測多種病原，是一種高效且簡便的檢測方法。目前用于弧菌多重PCR 檢測的靶基因大多是看家基因gyrB、toxR、rpoS 等，或毒力基因flaE、vvh、膠原酶基因等[3]，因?yàn)椴煌N弧菌中基因序列不同，在同種弧菌中表現(xiàn)差異較小。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和地域的擴(kuò)大以及保育物種增加等因素，近年來新型菌株的不斷出現(xiàn)，Kemp 等[4]發(fā)現(xiàn)弧菌會在患有白斑病的鹿角珊瑚（Acropora palmata）的病灶中快速增殖。新發(fā)現(xiàn)的菌株的基因型與以往菌株不同，這就可能導(dǎo)致原來用于多重PCR 的特異性引物喪失其特異性。為了準(zhǔn)確地檢測致病弧菌，本試驗(yàn)選取溶藻弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的不同目的基因的引物，在驗(yàn)證它們特異性的基礎(chǔ)上進(jìn)行了多重PCR 反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，并通過人工感染大菱鲆驗(yàn)證多重PCR 的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離株16 株（實(shí)驗(yàn)室保存，寧波大學(xué)王國良老師惠贈，大連海洋大學(xué)王斌老師恵贈）、試驗(yàn)用魚（大連某海水養(yǎng)殖場)、合成的引物（根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]，提交上海生工合成）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用抽提法[7]和水煮法進(jìn)行DNA 模板的制備，根據(jù)用于檢測溶藻弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的引物，選取退火溫度相似、特異性較強(qiáng)、由不同目的基因設(shè)計(jì)的引物，提交上海生工合成。制備好的DNA 模板進(jìn)行PCR 檢測并觀察其結(jié)果，再以溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌的DNA 混合物為模板，對多重PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化及靈敏度的測定。最后將3 種菌等濃度混合后腹腔注射感染大菱鲆，注射劑量為0.1 mL/尾，每組10 尾；空白對照組10 尾，注射相同劑量的滅菌生理鹽水。感染后分別于0.5、2、4、10、24 h 無菌操作取肝臟和腎臟組織各0.1 g，分別進(jìn)行單重PCR 和多重PCR 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的特異性

3 種弧菌的9 對引物中，有3 對具有較強(qiáng)的特異性（表1）。

2.2 多重PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

由圖1 可知，最終選擇58 ℃作為退火溫度，后續(xù)的試驗(yàn)均在此基礎(chǔ)上進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)；由圖2可知，最終引物的濃度確定為溶藻弧菌的引物濃度為4 pmol/μL，副溶血弧菌的引物濃度為5 pmol/μL，創(chuàng)傷弧菌的引物濃度為2.5 pmol/μL；由圖3 可知，當(dāng)Mg2+為2.0 mmol/L時(shí)可得到均一穩(wěn)定、清晰的擴(kuò)增條帶。

表1 3 對較強(qiáng)特異性引物

圖1 副溶血弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌的多重PCR溫度梯度試驗(yàn)

圖2 副溶血弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌引物濃度梯度多重PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 多重PCR 的靈敏度

在上述優(yōu)化的反應(yīng)條件下，多重PCR 對溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌的靈敏度分別為102、102和103CFU/mL。

圖3 副溶血弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌Mg2+濃度梯度多重PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 人工感染大菱鲆的多重PCR 檢測

將3 株菌注射到大菱鲆腹腔內(nèi)后，分別取大菱鲆的肝臟和腎臟0.1 g 進(jìn)行組織勻漿后，使用2 種提取方法提取DNA，陰性對照組的大菱鲆注射滅菌生理鹽水，檢測結(jié)果見表2。

表2 混合感染試驗(yàn)魚體多重PCR 檢測結(jié)果

3 討 論

致病弧菌（以下簡稱“弧菌”）給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的危害嚴(yán)重，不同弧菌的流行病學(xué)特征類似，有時(shí)還會發(fā)生混合感染，因此，弧菌的檢測技術(shù)對弧菌的防治至關(guān)重要。PCR 技術(shù)近年來被廣泛用于各種細(xì)菌的檢測，但是常規(guī)的PCR 一次只能檢測1 種細(xì)菌，效率較低，而多重PCR 是一種可同時(shí)檢測多種弧菌的良好方法。

特異性高的PCR 是基于檢測對象的特異性基因，最常用的是利用16S rRNA 基因鑒定細(xì)菌，但是由于該基因具有高度保守性，只依靠16S rRNA 不能準(zhǔn)確鑒定到種。Kita-Tsukamoto 等[8]對副溶血弧菌和溶藻弧菌的16S rRNA 序列進(jìn)行了分析，認(rèn)為二者的相似性大于99%。因此，許多學(xué)者開始了弧菌的毒力基因序列或看家基因序列的研究，發(fā)展了許多以這些基因?yàn)榛A(chǔ)的弧菌的PCR 檢測方法[6]。多重PCR 雖然可以同時(shí)檢測多種基因，但是由于體系中包含多對引物，容易出現(xiàn)非靶基因交叉擴(kuò)增。flaE、vvh 和膠原酶基因均為弧菌毒力基因，經(jīng)常被用于各種弧菌的檢測，Tarr 等[9]利用flaE 基因鑒定副溶血弧菌，特異性良好；徐義剛等[10]以flaE 基因?yàn)榘谢?，建立了溶藻弧菌的LAMP 檢測方法。本研究證明，通過上述3 個(gè)基因的特異性引物建立的溶藻弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌多重PCR 檢測法不與其他細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)，靈敏度約為102～103CFU/mL。Yin等[11]建立的多重降落PCR 方法檢測創(chuàng)傷弧菌的靈敏度為104CFU/mL，對溶藻弧菌和副溶血弧菌的靈敏度為103CFU/mL，由此可見，本研究的多重PCR 檢測法靈敏度較高。

為了接近養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)際，實(shí)驗(yàn)室采用多重PCR檢測3 種弧菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株感染大菱鲆的組織勻漿液。本試驗(yàn)對組織勻漿液中5 種致病菌的最低檢測濃度都小于或約等于1.0×104CFU/g。據(jù)靳素英等[12]報(bào)道，當(dāng)水中弧菌濃度為104時(shí)，是發(fā)病臨界菌量；弧菌濃度為105時(shí)，就可能導(dǎo)致弧菌病產(chǎn)生[13]。本研究對組織勻漿液中的致病菌檢測的靈敏度低于這個(gè)閾值，而且多重PCR 的檢測結(jié)果與單重PCR 基本相同，說明本研究建立的多重PCR 檢測方法在實(shí)際生產(chǎn)中用于致病菌的檢測是完全可行的。綜上所述，本研究建立的溶藻弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌多重PCR 檢測法特異性強(qiáng)、靈敏度高，而且方便快捷，有望成為實(shí)際生產(chǎn)中檢測致病弧菌的有效手段。