跨膜蛋白16A對(duì)胚胎著床和子宮內(nèi)膜容受性的影響

楊一凡，謝青貞

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060)

胚胎著床是活性胚胎在容受態(tài)子宮內(nèi)膜上進(jìn)行定位、粘附、侵入從而與子宮內(nèi)膜建立緊密連接的過(guò)程。胚胎只有在特定的時(shí)期才能在子宮內(nèi)膜上進(jìn)行著床，此時(shí)子宮內(nèi)膜處于容受狀態(tài)，這個(gè)時(shí)期稱(chēng)為“窗口期”，人一般在排卵后第7～9天(人正常月經(jīng)周期第21～23天)[1]。雌激素(E2)和孕激素(P4)是調(diào)控胚胎著床的主要激素，在E2和P4的協(xié)同作用下，包括細(xì)胞因子、粘附分子、生長(zhǎng)因子等在內(nèi)的諸多分子進(jìn)行時(shí)空特異性對(duì)話，LIF和整合素αvβ3于人正常月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜上高表達(dá)時(shí)間與“窗口期”開(kāi)放時(shí)間同步，因此它們常作為子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性分子[2-3]。

跨膜蛋白16A(TMEM16A)又稱(chēng)ANO1(anoctamin 1)，其基因定位于人類(lèi)染色體11q13區(qū)域，此區(qū)域的很多基因在上皮類(lèi)癌癥中高表達(dá)，因此在被確認(rèn)為CaCCs的分自助基礎(chǔ)之前，TMEM16A主要在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的行為表觀學(xué)和機(jī)制研究中被大家熟知[4-5]。2008年3個(gè)頂級(jí)實(shí)驗(yàn)室證實(shí)TMEM16A是鈣激活氯離子通道(CaCCs)的分子基礎(chǔ)，由此關(guān)于TMEM16A的研究得以展開(kāi)[6-8]?，F(xiàn)已知TMEM16A在氣管、胃腸道和血管平滑肌等多種器官和組織中廣泛表達(dá)，并參與相應(yīng)的生理反應(yīng)過(guò)程[9-11]。在生殖系統(tǒng)中，TMEM16A被認(rèn)為可以促進(jìn)小鼠子宮平滑肌的收縮[12]；在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了TMEM16A的表達(dá)，并通過(guò)MEK/ERK途徑影響雌激素的合成[13]；在輸卵管中，TMEM16A可改變輸卵管平滑肌的收縮從而影響輸卵管對(duì)精子、卵母細(xì)胞和受精卵的運(yùn)輸[14]。我們的前期研究同樣證實(shí)了TMEM16A表達(dá)于人正常月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜，并于月經(jīng)周期的不同時(shí)期存在差異性表達(dá)，可能受到卵巢雌、孕激素的調(diào)節(jié)[15]。我們的體外實(shí)驗(yàn)亦提示[16]，人子宮內(nèi)膜Ishikawa細(xì)胞在E2和，P4的聯(lián)合作用下，TMEM16A的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組和E2以及P4單獨(dú)作用組。由此，本研究擬通過(guò)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)比較空白對(duì)照組和T16A inh-A01組中Ishikawa細(xì)胞與滋養(yǎng)層細(xì)胞細(xì)胞系HTR8-Svneo粘附作用程度的差別并在子宮內(nèi)膜細(xì)胞Ishikawa中加入E2、P4及TMEM16A特異性抑制劑T16A inh-A01后比較子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子LIF 和整合素αvβ3表達(dá)水平變化，以此探討TMEM16A對(duì)胚胎著床和子宮內(nèi)膜容受性的影響。

材料和方法

一、主要材料和試劑

子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞Ishikawa由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊增明教授饋贈(zèng)，HTR8-Svneo由武漢大學(xué)人民醫(yī)院范翠芳教授饋贈(zèng)。炭吸附胎牛血清(Gibco，美國(guó))、無(wú)酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))、q RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara Bio，日本)、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara Bio，日本)、TMEM16A兔抗人多克隆一抗(Abcam ab72984，英國(guó))、LIF兔抗人多克隆一抗(Abcam ab113262，英國(guó))、整合素αvβ3兔抗人多克隆一抗(博奧森 bs-1310R)、內(nèi)參β-actin(賽維爾生物)、山羊抗兔二抗(ASPEN AS1107)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天)、5×蛋白上緩沖液(谷歌生物)、鈣黃綠素-AM(翊盛生物)、T16Ainh-A01(Sigma，美國(guó))。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

子宮內(nèi)膜細(xì)胞Ishikawa為貼壁細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇后置于含10%炭吸附胎牛血清的無(wú)酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代，按2×106個(gè)/孔將細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后用含0.5%炭吸附胎牛血清的無(wú)酚紅RPMI-1640饑餓處理，24 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組和相應(yīng)處理。

2.qRT-PCR法檢測(cè)各組TMEM16、LIF和整合素αvβ3 mRNA在 Ishikawa中的表達(dá)水平

細(xì)胞饑餓處理24 h后，空白對(duì)照組加入0.1% DMSO，E2+P4組加入10 nmol/L E2和1 μmol/L的P4，均培養(yǎng)48 h；抑制劑組加入10 μmol/L T16Ainh-A01，培養(yǎng)24 h；E2+P4+抑制劑組先加入10 nmol/L E2和1 μmol/L的P4培養(yǎng)48 h，換液后再加入10 μmol/L T16Ainh-A01培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，按Trizol試劑說(shuō)明提取各組細(xì)胞的Total RNAs，測(cè)定各組Total RNAs的濃度及OD值，若OD值在1.8～2.2之間，各組取1 μg Total RNA，按照說(shuō)明書(shū)，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒去除基因組DNA，總體系為10 μl。隨后按逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)利用Applied Biosystems VeritiTM96-Well Thermal Cycle儀器(Applies Biosystem，美國(guó))對(duì)Total RNAs進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl。逆轉(zhuǎn)錄后用Applied BiosystemTM7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument(Applies Biosystem，美國(guó))進(jìn)行qPCR。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。qRT-PCR所用引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

3.Western blot檢測(cè)各組TMEM16A、LIF和整合素αvβ3蛋白在Ishikawa中的表達(dá)水平

細(xì)胞饑餓處理24 h后，空白對(duì)照組加入0.1% DMSO，E2+P4組加入10 nmol/L E2和1 μmol/L P4，均培養(yǎng)48 h；抑制劑組加入10 μmol/L T16Ainh-A01，培養(yǎng)24 h；E2+P4+抑制劑組先加入10 nmol/L E2和1 μmol/L P4培養(yǎng)48 h，PBS清洗3次，換液后再加入10 μmol/L T16Ainh-A01培養(yǎng)24 h。用TBS緩沖液潤(rùn)洗貼壁細(xì)胞2～3次，最后一次盡量吸干殘留液。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑于6孔板內(nèi)裂解3～5 min。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5 ml離心管中。冰浴30 min。4℃ 13 000 g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品的蛋白濃度，加入適量5×蛋白上緩沖液后煮沸8 min使蛋白變性，使用12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本，然后將凝膠上分離的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗Anti-TMEM16A antibody (1∶1 000)，Anti-LIF antibody(1∶1 000)，Anti-整合素 αvβ3 antibody(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。PBS漂洗3遍后，二抗(1∶20 000)室溫孵育1 h，再次用PBS漂洗3遍，使用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜并分析條帶。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

4.體外細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，E2+P4組和E2+P4+抑制劑組Ishikawa細(xì)胞和HTR8-Svneo細(xì)胞間的粘附作用

細(xì)胞饑餓處理24 h后，E2+P4組加入10 nmol/L E2和1 μmol/L的P4，均培養(yǎng)48 h；E2+P4+抑制劑組先加入10 nmol/L E2和1 μmol/L的P4培養(yǎng)48 h，PBS清洗3次，換液，再加入10 μmol/L T16Ainh-A01培養(yǎng)24 h。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道1，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)抑制劑組和空白對(duì)照組中Ishikawa細(xì)胞和HTR8-Svneo細(xì)胞之間的粘附作用。將各組Ishikawa細(xì)胞按5×104個(gè)/孔單層均勻鋪在96孔板上。HTR8-Svneo在含有10%炭吸附胎牛血清和1%青鏈霉素的無(wú)酚紅RPMI-1640中培養(yǎng)，加入5 μmol/L的活細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)染料鈣黃綠素-AM，置于37℃，5% CO2環(huán)境中進(jìn)行活細(xì)胞染色2 h。將HTR8-Svneo按4×104個(gè)/孔單層均勻鋪在含有Ishikawa細(xì)胞的96孔板中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2 h。用PBS洗滌3遍，洗凈未粘附的HTR8-Svneo細(xì)胞。用酶標(biāo)儀(PerkinElmer 1420-050，美國(guó))檢測(cè)E2+P4組和E2+P4+抑制劑組之間兩種細(xì)胞粘附作用的差異(鈣黃綠素激發(fā)波長(zhǎng)：485 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：535 nm)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23軟件，計(jì)量資料多組比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組計(jì)量資料比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各處理因素對(duì)TMEM16A mRNA和蛋白表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果明確顯示各組Ishikawa細(xì)胞中TMEM16A mRNA和蛋白的表達(dá)情況(圖1A)。與空白對(duì)照組相比，抑制劑組TMEM16A mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。E2+P4組的表達(dá)水平最高(P<0.01)，與其他3組相比均具有顯著差異變化(P<0.01)。E2+P4+T16Ainh-A01的表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)。Western Blot結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致(圖1B)。

兩組之間比較，**P<0.01圖1 qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)各組Ishikawa細(xì)胞TMEM16A mRNA和蛋白表達(dá)水平

二、各處理因素對(duì)LIF、整合素 αvβ3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果明確顯示了各組Ishikawa細(xì)胞LIF和整合素 αvβ3 mRNA的表達(dá)水平(圖1A、B)。與空白對(duì)照組相比，抑制劑組中LIF和αvβ3 mRNA水平均顯著低于空白對(duì)照組(P均<0.05)。E2+P4組中LIF和αvβ3 mRNA表達(dá)水平最高(P<0.01)，加入T16Ainh-A01后LIF和αvβ3 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，但顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。

Western Blot結(jié)果明確顯示了各組LIF和Integrin蛋白的表達(dá)水平(圖1C、D、E)。Western Blot結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果基本一致。

三、T16Ainh-A01對(duì)Ishikawa細(xì)胞和HTR8-SVneo細(xì)胞之間粘附作用的影響

體外粘附實(shí)驗(yàn)顯示了E2+P4+抑制劑組的OD值顯著低于E2+P4組，說(shuō)明E2+P4+抑制劑組 Ishikawa細(xì)胞與HTR8-SVneo細(xì)胞之間的粘附作用顯著小于E2+P4組(P<0.01)。

兩組之間比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)各組Ishikawa細(xì)胞LIF和整合素αvβ3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

兩組之間比較，**P<0.01圖3 體外細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)空白對(duì)照組和抑制劑組Ishikawa細(xì)胞和HTR8-SVneo細(xì)胞的粘附作用

討 論

胚胎著床是一個(gè)復(fù)雜的、受到精細(xì)調(diào)控的生理過(guò)程。在雌、孕激素的共同調(diào)節(jié)下，子宮內(nèi)膜由非容受態(tài)轉(zhuǎn)為容受態(tài)，使活化的胚胎在子宮內(nèi)膜上進(jìn)行定位、粘附和侵入，成功建立妊娠，其中包括粘附分子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等分子和基質(zhì)金屬蛋白酶等因子共同參與到胚胎著床過(guò)程中。其中LIF和整合素αvβ3常被用于評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的指標(biāo)。LIF 由雌激素誘導(dǎo)產(chǎn)生，對(duì)胚胎著床和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化是必須的。下調(diào)LIF的表達(dá)與女性不孕中的著床缺陷相關(guān)，許多哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)，LIF 在著床期的表達(dá)明顯升高，表明LIF是調(diào)控著床的關(guān)鍵性因子[17]。整合素 αvβ3是細(xì)胞粘附分子家族的一員，通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)、其他細(xì)胞粘附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶等相互作用，參與到廣泛的生理過(guò)程中。整合素 αvβ3被證實(shí)在人子宮內(nèi)膜上的表達(dá)呈周期性變化，于分泌期表達(dá)最強(qiáng)并與窗口期相吻合且特異性的出現(xiàn)于胞飲突，以上結(jié)論均支持整合素 αvβ3作為容受性標(biāo)志物的學(xué)說(shuō)[18-19]。

TMEM16A又稱(chēng)ANO1，胃腸道間質(zhì)瘤蛋白1(DOG-1)，口腔癌癥過(guò)表達(dá)蛋白2(ORAOV2)以及腫瘤擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)序列2(TAOS-2)，它早先在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等相關(guān)研究中被大家熟知，在臨床上它已成為胃腸道間質(zhì)腫瘤的一個(gè)生物學(xué)標(biāo)記。2008年被確定為CaCCs的分子基礎(chǔ)后，大量相關(guān)研究得以展開(kāi)。我們先前的研究證實(shí)了TMEM16A在人子宮內(nèi)膜及Ishikawa細(xì)胞上也存在表達(dá)并受卵巢E2、P4調(diào)節(jié)發(fā)生周期性變化[16]。

Ishikawa細(xì)胞是高分化的子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞，其具有E2和 P4受體并具有正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞相關(guān)特性，因此常作為正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞用于相關(guān)研究[20-21]。為了進(jìn)一步確定TMEM16A對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響，我們?cè)隗w外培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、E2+P4組、抑制劑組和E2+P4組+抑制劑組。通過(guò)qRT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組TMEM16A和容受性分子LIF及整合素 αvβ3的表達(dá)情況。結(jié)果提示，E2+P4組中TMEM16A、LIF和整合素αvβ3的表達(dá)均顯著高于其他三組(P<0.01)；抑制劑組中TMEM16A、LIF及整合素αvβ3的表達(dá)水平均顯著低于其他三組(P<0.01)；E2+P4+抑制劑組中，3種分子表達(dá)水平明顯高于抑制劑組和對(duì)照組(P<0.01)，顯著小于E2+P4組(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明，人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中存在TMEM16A的表達(dá)，加入特異性抑制劑T16Ainh-A01后，TMEM16A的表達(dá)明顯受到抑制，且TMEM16A表達(dá)受到抑制的同時(shí)，容受性標(biāo)志分子LIF和整合素αvβ3的表達(dá)明顯降低；TMEM16A在 “窗口期”時(shí)的表達(dá)顯著增高，且LIF和整合素αvβ3在“窗口期”的表達(dá)達(dá)到高峰，但加入T16Ainh-A01后上述分子的高表達(dá)同樣受到抑制。TMEM16A在人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的的表達(dá)水平變化可影響容受性分子LIF和整合素αvβ3的表達(dá)水平，從而有可能影響子宮內(nèi)膜的容受性。但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究證明。

胚胎著床是活性胚胎在容受態(tài)的子宮內(nèi)膜上定位、粘附和侵入的過(guò)程。我們通過(guò)對(duì)比E2+P4組和E2+P4+抑制劑組 Ishikawa細(xì)胞與滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8-Svneo之間的粘附能力，初步探討TMEM16A對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞-子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞之間粘附作用的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與E2+P4組相比，E2+P4+抑制劑組Ishikawa細(xì)胞與HTR8-Svneo細(xì)胞之間的粘附作用明顯降低(P<0.01)。提示降低子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TMEM16A的表達(dá)可抑制胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞之間的粘附作用，進(jìn)而影響胚胎著床。

胚胎著床的“三明治”模型提示：在子宮內(nèi)膜腺上皮表面和胚泡表面均有整合素αvβ3的表達(dá)。作為骨橋蛋白(OPN)的受體，子宮內(nèi)膜和胚泡上的整合素αvβ3均可以和OPN結(jié)合。OPN夾在兩個(gè)整合素分子之間，形成了一個(gè)識(shí)別復(fù)合物，介導(dǎo)胚泡與子宮內(nèi)膜的交互對(duì)話和胚泡-子宮內(nèi)膜的粘附作用。在“窗口期”，整合素αvβ3受甾體激素和一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的調(diào)控，從而表達(dá)顯著增加，使子宮內(nèi)膜達(dá)到最大的容受狀態(tài)，促進(jìn)胚胎像子宮內(nèi)膜上粘附。我們的結(jié)果表明，在E2和P4的作用下，抑制TMEM16A的表達(dá)，整合素αvβ3表達(dá)減少的同時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞之間的粘附作用顯著降低，提示TMEM16A可能影響整合素αvβ3的表達(dá)從而調(diào)控胚胎與子宮內(nèi)膜的粘附。