谷氨酰胺對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用

胡雪，吳庚香，楊菁

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性常見的內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、不孕、多毛、痤瘡，常伴有腹型肥胖和胰島素抵抗，遠(yuǎn)期可有糖尿病、心血管疾病、代謝綜合征等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響女性身心健康。PCOS的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，近年來研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)和慢性炎癥反應(yīng)與PCOS的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。谷氨酰胺(Gln)是人體含量最為豐富的游離氨基酸和重要的氮運(yùn)載體和供體，能被氧化釋放能量，在體內(nèi)參與能量代謝、生物合成、抗氧化及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程[1]，常作為一種腸內(nèi)營養(yǎng)物在臨床中廣泛應(yīng)用。本研究對(duì)PCOS大鼠模型給予Gln干預(yù)，通過檢測(cè)大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)變化，探討Gln對(duì)PCOS大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)作用，以期為PCOS的治療提供新的途徑。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

30只21日齡未成年雌性SD大鼠，購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為對(duì)照組、PCOS組、PCOS+Gln組，每組各10只，各組大鼠分籠編號(hào)喂養(yǎng)。

二、主要試劑及器材

脫氫表雄酮(上海阿拉丁試劑有限公司)；丙氨酰谷氨酰胺注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司)；激素ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；氧化應(yīng)激指標(biāo)生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)；酶標(biāo)儀(Biotek，美國)

三、研究方法

1.動(dòng)物模型構(gòu)建：SD大鼠PCOS動(dòng)物模型構(gòu)建參考Di等[2]的研究，方法如下：所有大鼠均于21日齡斷乳，進(jìn)食普通飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，自23日齡起，PCOS組及PCOS+Gln組每日18：30～20：00頸部皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)60 mg/kg(溶于0.2 ml橄欖油)，對(duì)照組每日頸部皮下注射等量橄欖油，連續(xù)注射20 d。造模完成后次日晨8：00，PCOS+Gln組腹腔注射谷氨酰胺0.75 g/kg，方法參考Kim等[3]的方法，PCOS組及對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，12：00各組大鼠再次給予相同處理，當(dāng)日20：00起所有大鼠禁食12 h后，斷尾采血，吸入異氟烷麻醉，下腔靜脈采血及取雙側(cè)卵巢組織，血液離心取血清保存于-80℃，一側(cè)卵巢組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，另一側(cè)卵巢組織保存于-80℃。

2.血清激素、胰島素和空腹血糖測(cè)定：血糖測(cè)定取尾靜脈血，血糖儀檢測(cè)隨機(jī)血糖，下腔靜脈血檢測(cè)睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)，胰島素(INS)，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，簡單介紹如下：用碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/ml，在聚苯乙烯酶標(biāo)板的每孔加100 μl，4℃過夜進(jìn)行包被，每孔加入封閉液并洗滌。加適當(dāng)稀釋的待檢樣品100 μl于已包被的反應(yīng)孔中，同時(shí)做空白孔和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品孔，封板膜封板后置37℃孵育1～2 h，于各孔中加稀釋好的生物素化抗體工作液100 μl，37℃孵育1 h，洗滌后于各孔中加稀釋好的酶結(jié)合物工作液100 μl，37℃避光孵育30 min，于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37℃避光反應(yīng)10～30 min，直到倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯的顏色梯度為止。于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸100 μl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上，于450 nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣本濃度。

3.血清氧化應(yīng)激水平測(cè)定：氧化應(yīng)激指標(biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)，參照各自相應(yīng)的生化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管，分別按說明書加入相應(yīng)的試劑和顯色劑，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定各管吸光度值并計(jì)算樣品各指標(biāo)的含量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組大鼠卵巢組織學(xué)觀察

各組大鼠卵巢組織HE染色結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠卵巢可見不同發(fā)育階段的卵泡及多個(gè)黃體形成，卵泡顆粒細(xì)胞層較多，成熟卵泡內(nèi)有卵母細(xì)胞和放射冠，而PCOS組和PCOS+Gln組大鼠卵巢表面見較多囊性擴(kuò)張的卵泡，卵泡膜細(xì)胞增生，顆粒細(xì)胞層明顯減少，卵泡內(nèi)無卵母細(xì)胞和放射冠，較少有黃體形成(圖1)。

圖1 各組大鼠卵巢HE染色×100

二、血清激素及代謝指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，PCOS組和PCOS+Gln組大鼠血清睪酮、黃體生成素濃度均明顯升高，僅PCOS+Gln組大鼠空腹血糖、空腹胰島素水平顯著升高 (P<0.05)；與PCOS組相比，PCOS+Gln組大鼠血清睪酮、空腹胰島素和空腹血糖顯著升高 (P<0.05)(表1)。

三、血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，PCOS組大鼠血清MDA、NO和NOS濃度均顯著升高，SOD濃度顯著下降 (P均<0.05)；與PCOS組相比，PCOS+Gln組大鼠血清MDA、NO和NOS濃度均顯著下降，而SOD濃度顯著升高(P均<0.05)(圖2)。

表1 各組大鼠血清激素及代謝指標(biāo)濃度的比較(-±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PCOS組比較，#P<0.05

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PCOS組比較，**P<0.05圖2 各組大鼠血清氧化應(yīng)激水平的比較

討 論

由于PCOS的病因不清，目前對(duì)于PCOS患者的治療并不能根治，主要是抗雄激素、增加胰島素敏感性、促進(jìn)排卵和預(yù)防遠(yuǎn)期并發(fā)癥。Gln雖然在臨床應(yīng)用廣泛，但在生殖內(nèi)分泌疾病中應(yīng)用極少，因PCOS發(fā)病與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，而Gln具有抗氧化作用，本研究首次將Gln應(yīng)用于PCOS大鼠模型，具有創(chuàng)新性和新穎性。PCOS動(dòng)物模型構(gòu)建方法有多種，本研究中采用簡便、可行性高的連續(xù)皮下注射DHEA方法構(gòu)建PCOS大鼠模型，結(jié)果顯示在DHEA誘導(dǎo)下SD雌性大鼠的卵巢組織呈現(xiàn)多囊樣改變，并且內(nèi)分泌改變也與PCOS患者相似，再次證明了這種造模方法的穩(wěn)定性，為本研究檢測(cè)各組大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平變化及給予Glu干預(yù)結(jié)果的準(zhǔn)確性奠定了基礎(chǔ)。

機(jī)體在生理狀態(tài)下，氧化與抗氧化反應(yīng)處于動(dòng)態(tài)平衡中，而當(dāng)機(jī)體活性自由基產(chǎn)生過多或抗氧化能力降低，氧化還原過程失衡，則會(huì)發(fā)生病理反應(yīng)，引起糖化氧化作用、脂質(zhì)氧化損傷、蛋白質(zhì)過氧化反應(yīng)以及DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、組織器官損害和疾病的發(fā)生[4]。NO是一種活性氮，參與氧化反應(yīng)；NOS能提高NO的含量和活性；MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，反映了細(xì)胞膜受損程度；SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，具有抗氧化作用。大量研究[5-6]表明，PCOS患者體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，PCOS患者血清及動(dòng)物模型卵巢組織均存在MDA水平增高和SOD水平降低的現(xiàn)象，本研究中，DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠血清MDA水平較對(duì)照組升高，SOD水平較對(duì)照組降低，與上述研究結(jié)果相同。PCOS患者體內(nèi)NO水平變化觀點(diǎn)不一[7-8]，本研究結(jié)果顯示與劉廣南等[7]研究一致，PCOS大鼠體內(nèi)NO及NOS水平升高。氧化應(yīng)激與PCOS的胰島素抵抗、高雄激素血癥、不孕等均有密切聯(lián)系[9-10]，對(duì)PCOS的發(fā)生發(fā)展有重要影響，還可能影響PCOS患者行體外受精-胚胎移植的臨床結(jié)局[11]，張丹等[12]發(fā)現(xiàn)對(duì)PCOS患者用炔雌醇環(huán)丙孕酮片聯(lián)合維生素C及維生素E(抗氧化劑)口服治療3個(gè)月后，MDA水平下降，而SOD水平升高，且聯(lián)合治療組的PCOS患者月經(jīng)恢復(fù)情況也比單用炔雌醇環(huán)丙孕酮片理想。

Gln是一類人體非必需氨基酸，有改善疾病預(yù)后，提高免疫力的作用[13]。其作為抗氧化物谷胱甘肽的前體，可以提高體內(nèi)谷胱甘肽的水平，增強(qiáng)氧化防御功能，減輕氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)；還可以通過誘導(dǎo)熱休克蛋白70的表達(dá)及抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗氧化效能[14-15]。Gln在各種疾病導(dǎo)致的急危重癥、胃腸手術(shù)后、燒傷創(chuàng)傷及腫瘤等疾病中應(yīng)用廣泛，但在生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病中極少應(yīng)用。本研究對(duì)PCOS大鼠給予Gln短期治療后，血清MDA、NO、NOS水平顯著降低，而SOD水平明顯升高，證明Gln對(duì)PCOS大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平也有調(diào)節(jié)作用?？寡趸瘎┲兴幵谔岣逷COS大鼠體內(nèi)抗氧化能力的同時(shí)，可改善PCOS大鼠胰島素抵抗和高雄激素血癥[7]，并且Mansour等[16]對(duì)2型糖尿病患者連續(xù)給予Gln 6周后發(fā)現(xiàn)其能降低空腹血糖和胰島素，然而本研究結(jié)果顯示Gln對(duì)PCOS大鼠體內(nèi)的睪酮、空腹血糖、胰島素水平并沒有改善作用，這可能與本研究Gln干預(yù)時(shí)間較短、樣本量少相關(guān)。

綜上所述，PCOS大鼠體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，氧化應(yīng)激指標(biāo)升高，抗氧化指標(biāo)下降，給予Gln干預(yù)能顯著降低MDA、NO、NOS水平、顯著升高SOD水平，減輕PCOS大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，為PCOS的治療提供了新的途徑。本研究的缺點(diǎn)在于Gln干預(yù)的時(shí)間較短、導(dǎo)致內(nèi)分泌和代謝情況不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，并且對(duì)于Gln干預(yù)后的PCOS大鼠遠(yuǎn)期并發(fā)癥情況沒有檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，因此本課題組在后期的研究中會(huì)針對(duì)這些問題進(jìn)行改進(jìn)，以期獲得更全面更準(zhǔn)確的結(jié)果，為PCOS的治療提供可靠的依據(jù)。