胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的臨床應(yīng)用分析

黃秋香，王志紅，劉蕓*，林春麗，陳智鏢，黃吳鍵，毛麗華，何凌云

(福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院(第九○○醫(yī)院)/廈門(mén)大學(xué)附屬東方醫(yī)院(第九○○醫(yī)院)1.婦產(chǎn)科生殖中心；2. 實(shí)驗(yàn)科，福州 350025)

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)技術(shù)是針對(duì)具有明確的致病基因或染色體異常攜帶者的夫婦進(jìn)行促排卵，借助體外受精-胚胎移植技術(shù)對(duì)早期胚胎進(jìn)行植入前活檢和遺傳學(xué)分析，將檢測(cè)正常的胚胎植入子宮，從而獲得健康胎兒的一種孕前診斷技術(shù)。Handyside等[1]首次成功應(yīng)用PGD技術(shù)使一對(duì)有性連鎖隱性遺傳病的夫婦誕下健康女?huà)?。此后PGD技術(shù)發(fā)展迅猛，結(jié)合人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，幫助有遺傳風(fēng)險(xiǎn)夫婦精準(zhǔn)檢測(cè)其胚胎實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，有效控制了出生缺陷。PGD目前主要應(yīng)用于染色體異常和單基因遺傳病兩大類疾病的檢測(cè)，雖然國(guó)內(nèi)很多研究報(bào)道PGD能明顯改善臨床結(jié)局[2-4]，但大部分僅對(duì)某一遺傳疾病進(jìn)行研究，尚缺乏全面臨床數(shù)據(jù)證實(shí)。因此本研究選取本中心136例PGD臨床病例，按照不同臨床適應(yīng)證進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為PGD技術(shù)的臨床應(yīng)用提供參考。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選取2013年11月至2017年12月在本院生殖中心行PGD治療的136對(duì)夫婦作為研究對(duì)象。所有夫婦均經(jīng)過(guò)遺傳咨詢并簽署PGD知情同意書(shū)。本PGD項(xiàng)目經(jīng)衛(wèi)生行政部門(mén)審批并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)開(kāi)展。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)染色體結(jié)構(gòu)異常：包括相互易位、羅氏易位、倒位、復(fù)雜易位、致病性微缺失或微重復(fù)等；(2)染色體數(shù)目異常：包括47，XYY綜合征、Turner綜合征、克氏征等；(3)有遺傳病家族史且已明確致病基因位點(diǎn)的常染色體顯性、常染色體隱性、性連鎖遺傳的單基因遺傳病夫婦。

二、方法

1. 胚胎體外受精、培養(yǎng)和活檢：采用本中心常規(guī)方案進(jìn)行控制性促排卵。取卵后4～6 h用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射受精，置于G1(Vitrolife，瑞典)微滴培養(yǎng)。取卵后D3觀察卵裂情況，將卵裂胚胎[受精日觀察原核(Pronucleus，PN)為2PN、0PN或1PN受精，不含多原核受精胚胎]轉(zhuǎn)入含有G2(Vitrolife，瑞典)微滴進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。至D5/D6/D7，對(duì)可行活檢胚胎參照文獻(xiàn)[5]操作，取5～10個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞。活檢過(guò)的胚胎冷凍保存。

2. PGD步驟：PGD檢測(cè)采用NGS技術(shù)。2013年11月至2017年08月期間，染色體病患者的活檢細(xì)胞采用SurePlex法(SurePlex DNA Amplication Kit，Illumina，美國(guó))進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(WGA)，擴(kuò)增產(chǎn)物使用Proton測(cè)序，檢測(cè)胚胎23對(duì)染色體，包括父源或母源異常染色體，篩除非整倍體及拷貝數(shù)變異(CNVs)4 Mbp以上缺失或重復(fù)的胚胎；2017年09月至12月期間，1例染色體缺失患者和14例平衡易位患者的活檢細(xì)胞采用多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(MALBAC)進(jìn)行WGA，擴(kuò)增產(chǎn)物使用Hiseq2500(Illumina，美國(guó))測(cè)序，檢測(cè)范圍同上述，且平衡易位患者的整倍體胚胎采用等位基因映射識(shí)別胚胎平衡易位攜帶狀態(tài)技術(shù)(MaReCS)經(jīng)單核苷酸多態(tài)性(SNP)連鎖分析區(qū)分正常胚胎和易位攜帶胚胎[6]。

單基因病PGD中1例馬凡綜合征患者的活檢細(xì)胞采用多重置換擴(kuò)增(MDA)(REPLI-g Single Cell Kit，Qiagen，德國(guó))進(jìn)行WGA，擴(kuò)增產(chǎn)物使用Proton測(cè)序，進(jìn)行SNP連鎖分析和突變位點(diǎn)序列分析；其他單基因病利用高通量測(cè)序技術(shù)同時(shí)進(jìn)行突變位點(diǎn)和染色體異常以及連鎖分析的新策略(MARSALA)[7]：患者的活檢細(xì)胞先采用MALBAC法進(jìn)行WGA，然后針對(duì)患者突變位點(diǎn)附近的SNP對(duì)WGA產(chǎn)物進(jìn)行特異性PCR，再將PCR產(chǎn)物與WGA產(chǎn)物混合，以低測(cè)序深度進(jìn)行NGS。

3. 胚胎移植與隨訪：根據(jù)PGD結(jié)果，擇期選擇正常胚胎進(jìn)行移植。移植后14 d檢測(cè)尿及血HCG，35 d后B超觀察到妊娠囊，可確認(rèn)為臨床妊娠。妊娠18～23周行羊膜腔穿刺，抽取羊水進(jìn)行產(chǎn)前診斷，并隨訪臨床結(jié)局。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以SPSS 19.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較用X2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PGD周期的臨床資料

2013年11月至2017年12月共行PGD 136例，172個(gè)取卵周期，女方平均年齡(29.9±4.2)歲。136例中，染色體病116例，8個(gè)病種，占85.3%，其中2例嵌合體，核型分別為45，X[43]/46，XX，[57]和46，XX，t(11；22)(q23；q11.2)[70]/46，XX[30]；單基因病20例，8個(gè)病種，占14.7%(表1)。

表1 PGD周期臨床資料(-±s)

二、PGD結(jié)果

全部采用囊胚期活檢，136個(gè)PGD周期共成功活檢474個(gè)胚胎：21個(gè)擴(kuò)增失敗(4.4%)，19個(gè)全基因組擴(kuò)增后未行NGS檢測(cè)(有3例患者由于活檢胚胎數(shù)目較多，檢測(cè)費(fèi)用較高，故選擇全部胚胎活檢、全基因組擴(kuò)增，數(shù)個(gè)胚胎行NGS檢測(cè))，明確診斷數(shù)434個(gè)，其中正?；驍y帶者胚胎221個(gè)，異常胚胎213個(gè)，胚胎正?；驍y帶者概率為50.9%。

染色體病PGD結(jié)果：共活檢403個(gè)胚胎，明確診斷數(shù)367個(gè)，正?；蛞孜粩y帶胚胎175個(gè)，其中易位組有30個(gè)胚胎經(jīng)SNP連鎖分析區(qū)分出21個(gè)正常胚胎和9個(gè)易位攜帶胚胎。2例嵌合體患者的6個(gè)胚胎，染色體異常率達(dá)66.7%，可能是由于母源嵌合較高比例異常染色體所致。比較兩種全基因組擴(kuò)增方法，即Sureplex法和MALBACA法，擴(kuò)增失敗率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

單基因病PGD結(jié)果：共活檢71個(gè)胚胎，明確診斷數(shù)67個(gè)，其中馬凡綜合征患者的3個(gè)胚胎僅進(jìn)行突變位點(diǎn)序列分析+SNP連鎖分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)胚胎為正常基因胚胎。其余單基因病家系的64個(gè)胚胎進(jìn)行MARSALA分析，發(fā)現(xiàn)有44個(gè)胚胎為正?；蛐突虮硇驼５闹虏』驍y帶者且染色體正常(表3、4)。

表2 染色體病PGD結(jié)果 [n(%)]

注：與SurePlex擴(kuò)增法比較，*P>0.05;#相互易位組24個(gè)胚胎被明確區(qū)分為正常和易位攜帶：17個(gè)為正常胚胎，7個(gè)為易位攜帶胚胎；羅氏易位組6個(gè)胚胎被明確區(qū)分為正常和易位攜帶：4個(gè)為正常胚胎，2個(gè)為易位攜帶胚胎

表3 隱性遺傳病PGD結(jié)果[n(%)]

注：Chr：染色體

表4 顯性遺傳病PGD結(jié)果 [n(%)]

注：Chr：染色體；*馬凡綜合征組中有3個(gè)活檢胚胎僅突變位點(diǎn)序列分析和SNP連鎖分析，不列入統(tǒng)計(jì)

三、PGD臨床妊娠結(jié)局

截止2018年9月30日，在136例PGD患者中，有12例患者無(wú)正常胚胎可移植，23例患者無(wú)囊胚形成，3例患者有正常胚胎但未解凍移植。

98例患者進(jìn)行了115個(gè)周期的解凍移植，均為單囊胚移植，解凍后復(fù)蘇率100%，76例獲臨床妊娠，臨床妊娠率66.1%(76/115)，4例流產(chǎn)，流產(chǎn)率5.3%(4/76)，2例多胎妊娠，2例發(fā)生宮外孕，11例持續(xù)妊娠中，59例已成功分娩31個(gè)男嬰和30個(gè)女?huà)?，?例單卵雙胎分娩的2個(gè)男嬰中有1個(gè)男嬰肺動(dòng)脈高壓，肺泡發(fā)育欠佳，另1個(gè)男嬰巨結(jié)腸外，其余嬰兒均身體健康。

采用 MaReCS技術(shù)檢測(cè)的患者解凍移植選擇胚胎時(shí)，首選正常胚胎，其次易位攜帶胚胎。13例染色體易位PGD患者進(jìn)行15個(gè)解凍移植周期，9例獲臨床妊娠，1例流產(chǎn)(表5)。

表5 PGD胚胎移植及臨床結(jié)局 [n(%)]

注：*相互易位組中10例患者移植的11個(gè)胚胎：10個(gè)正常胚胎(5個(gè)臨床妊娠)和1個(gè)易位攜帶胚胎(臨床妊娠，該患者僅1個(gè)正常胚胎，第一次移植未獲妊娠，此為第二次移植)；*羅氏易位組中3例患者移植的4個(gè)胚胎：3個(gè)正常胚胎(2個(gè)臨床妊娠，1個(gè)流產(chǎn))和1個(gè)易位攜帶胚胎(臨床妊娠，該患者無(wú)正常胚胎可移植)

討 論

2015年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(huì)(ESHRE)報(bào)道了62個(gè)中心5 780個(gè)取卵周期的數(shù)據(jù)：2 979個(gè)胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)周期，1 574個(gè)單基因疾病周期，1 071個(gè)染色體異常周期，108個(gè)X染色體連鎖疾病周期，48個(gè)社會(huì)性別選擇周期[8]。在本文統(tǒng)計(jì)中PGD患者以染色體異常居多，占85.3%(116/136)，染色體易位在其中占77.6%(90/116)，為最常見(jiàn)的染色體異常?？耸险鳌?7，XYY和染色體倒位等病例在開(kāi)展PGD治療初期列入PGD范圍，后根據(jù)胚胎檢測(cè)結(jié)果及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，我們認(rèn)為這部分病例采用常規(guī)體外受精即可或者若有不良孕產(chǎn)史者可行PGS治療，故2017年后就將克氏征、47，XYY和染色體倒位剔出PGD適應(yīng)證。PGD治療的單基因病有8個(gè)病種，地中海貧血最多，達(dá)65.0%(13/20)，可能與我中心地處地中海高發(fā)地域有關(guān)，同時(shí)也顯示出我們檢測(cè)單基因病的病種和周期數(shù)明顯少于文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)，分析其原因可能為：(1)本中心開(kāi)展PGD工作量并不大，所診療的患者中單基因病病種不夠多，需積累更多病例觀察；(2)單基因病的診斷技術(shù)仍需改善，待開(kāi)拓更多的可診斷病種和方法。

鑒于對(duì)卵裂期活檢局限性的研究報(bào)道[9-11]，以及受益于胚胎序貫培養(yǎng)至囊胚階段的成功、胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的開(kāi)展，囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢受到廣泛運(yùn)用，故本文全部采用囊胚期活檢，以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞保證足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，且保障了胚胎的安全。

本文采用具有高通量、低成本、耗時(shí)少等優(yōu)點(diǎn)的NGS技術(shù)進(jìn)行PGD。染色體疾病不再傳統(tǒng)地僅針對(duì)親代異常的染色體進(jìn)行檢測(cè)，而是全面檢測(cè)23對(duì)染色體，目前更進(jìn)步到利用MaReCS技術(shù)判斷胚胎的染色體易位攜帶狀態(tài)，成功地將30個(gè)胚胎區(qū)分為21個(gè)正常胚胎和9個(gè)易位攜帶胚胎，達(dá)到阻斷平衡易位向子代的傳遞。同時(shí)比較了兩種WGA方法的擴(kuò)增失敗率，因?yàn)閃GA是NGS關(guān)鍵一步，其擴(kuò)增的均一性和保真度是精確測(cè)定拷貝數(shù)變異和單核苷酸變異的前提條件，結(jié)果表明Sureplex法和MALBAC法在擴(kuò)增失敗率上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，可應(yīng)用于胚胎整倍性的NGS-PGD檢測(cè)，與Li等[12]研究報(bào)道一致。單基因病從最初突變位點(diǎn)序列分析結(jié)合STR連鎖分析，發(fā)展到一套完整的MARSALA技術(shù)，即突變位點(diǎn)序列分析+SNP單體型分析+染色體非整倍體分析，將單基因病家系PGD治療時(shí)女方年齡因素可影響胚胎染色體異常風(fēng)險(xiǎn)[13]因素考慮進(jìn)去，大大提升了PGD的準(zhǔn)確性和全面性，為選擇健康胚胎移植提供了有力保障。可見(jiàn)，基于NGS技術(shù)的PGD可精準(zhǔn)檢測(cè)出染色體異常和致病基因突變，對(duì)于獲取正常胚胎、阻斷遺傳病傳播、避免出生缺陷意義重大。

常規(guī)PGD治療后需要進(jìn)行孕期產(chǎn)前診斷，單胚胎移植可以避免雙胎或多胎妊娠造成產(chǎn)前診斷困難等不足，而且單囊胚移植在降低多胎妊娠率的同時(shí)仍能保持較高的臨床妊娠率[14-15]。故本文PGD患者均選擇單囊胚解凍移植，其臨床結(jié)局亦證實(shí)這點(diǎn)，臨床妊娠率66.1%，

多胎妊娠率2.6%，PGD治療后所有孕中期產(chǎn)前診斷結(jié)果與PGD結(jié)果一致，共出生31個(gè)男嬰和30個(gè)女?huà)?，結(jié)果令人滿意。值得一提的是，采用 MaReCS技術(shù)檢測(cè)，13例染色體易位PGD患者解凍移植13個(gè)正常胚胎和2個(gè)易位攜帶胚胎，分別有7個(gè)和2個(gè)獲臨床妊娠。截止2018年9月30日，有4個(gè)正常胚胎和1個(gè)易位攜帶胚胎移植后孕中期羊水診斷核型分析確認(rèn)結(jié)果與MaReCS結(jié)果一致，1個(gè)正常胚胎移植后流產(chǎn)，絨毛NGS檢測(cè)驗(yàn)證確認(rèn)結(jié)果亦與MaReCS結(jié)果一致?？梢?jiàn)，MaReCS技術(shù)有望為染色體易位患者家庭改寫(xiě)生育結(jié)局。