三種移植策略在反復(fù)種植失敗患者凍融胚胎移植周期中的應(yīng)用比較

金琪，駱麗華，黃玲莉，吳莉，王昊昱，童先宏，劉雨生

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)，合肥 230001)

在體外受精-胚胎移植中反復(fù)種植失敗(RIF)的發(fā)生率達(dá)10%～15%[1]。造成RIF的原因中1/3是胚胎質(zhì)量，2/3是子宮內(nèi)膜容受性不良[2]。基于此，從篩選優(yōu)質(zhì)胚胎、改善內(nèi)膜容受性以及促進(jìn)子宮內(nèi)膜與胚胎間相互作用這三個方面入手，尋求與之對應(yīng)的移植策略可能會給RIF患者帶來益處。囊胚移植可以挑選出更有發(fā)育潛能的胚胎，提高胚胎種植率及臨床妊娠率，因此廣泛應(yīng)用于RIF[3]。越來越多的研究者將序貫移植和內(nèi)膜機械性刺激應(yīng)用于臨床，試圖從改善內(nèi)膜容受性、促進(jìn)胚胎發(fā)育及種植來提高RIF患者妊娠成功率。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的移植方法相比，序貫移植和內(nèi)膜機械刺激均可以明顯提高RIF患者成功率[4-5]。但是這三種方法的優(yōu)劣及臨床如何決策，目前尚缺乏文獻(xiàn)評價。本研究將臨床上常用的三種移植策略應(yīng)用于RIF患者凍融胚胎移植周期中，并對臨床結(jié)果進(jìn)行比較，旨在為臨床選擇RIF的干預(yù)策略提供參考。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧分析2016年6月至2017年12月在我院實施凍融胚胎移植的228例(228個周期)RIF患者的妊娠結(jié)局。

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)RIF診斷標(biāo)準(zhǔn)：40歲以下女性在至少3個新鮮或冷凍周期中移植了4個以上優(yōu)質(zhì)胚胎后仍未實現(xiàn)臨床妊娠者視為RIF；(2)本次移植前宮腔鏡及陰道B超檢查宮腔及子宮內(nèi)膜符合以下條件：子宮內(nèi)膜厚度>7 mm、無明顯子宮內(nèi)膜炎癥、宮腔內(nèi)膜息肉或輕度宮腔粘連經(jīng)過處理宮腔形態(tài)屬于正常；(3)FSH<10 U/L，BMI<30 kg/m2；(4)有冷凍的第3天卵裂期和/或第 5 天囊胚期的胚胎，本次移植胚胎中至少有1枚優(yōu)質(zhì)胚胎。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫婦任何一方染色體異常；(2)合并內(nèi)科疾病如糖尿病、甲狀腺功能異常及自身免疫系統(tǒng)疾?。?3)中、重度宮腔粘連及子宮畸形；(4)血液高凝狀態(tài)；(5)子宮腺肌??；(6)輸卵管積水未行輸卵管近端結(jié)扎或輸卵管切除；(7)男方重度少弱精子癥。

3.分組：將患者分為研究組和對照組，研究組按照移植方案不同分為三組：A組(序貫移植組)：移植1枚卵裂期胚胎+1枚囊胚(40例)；B組(內(nèi)膜機械性刺激組)：根據(jù)胚胎移植時間及數(shù)量的不同分為兩個亞組，B1組：子宮內(nèi)膜機械性刺激+1枚囊胚移植(52例)；B2組：內(nèi)膜機械性刺激+2枚卵裂期胚胎移植(47例)；C組(囊胚移植組)：移植1枚囊胚(40例)。對照組為移植2枚卵裂期胚胎(49例)。

二、研究方法

1.移植方案：內(nèi)膜機械刺激方案：移植當(dāng)月月經(jīng)第3～5天采用小號刮匙輕柔搔扒宮腔一周，內(nèi)膜條件適宜時移植卵裂期胚胎或囊胚；序貫移植方案：不進(jìn)行內(nèi)膜機械刺激，僅在同一個周期先移植卵裂期胚胎1枚，兩天后再移植囊胚1枚；囊胚移植方案：移植1枚囊胚。

2.凍融胚胎移植(FET)的內(nèi)膜準(zhǔn)備：激素替代周期：月經(jīng)第3天開始口服戊酸雌二醇(補佳樂，廣州先靈藥業(yè))3 mg bid，10 d后B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，酌情調(diào)整藥物劑量。當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度>8 mm時加用黃體酮(黃體酮注射液，浙江仙琚)40 mg qd+地屈孕酮(達(dá)芙通，雅培，荷蘭)10 mg bid轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜第4天行卵裂期凍胚移植，第6天行囊胚移植。促排卵周期：適用于激素替代周期子宮內(nèi)膜生長不佳的患者。具體促排方案：月經(jīng)第3天開始來曲唑(芙瑞，江蘇恒瑞醫(yī)藥)2.5～5 mg/d，或他莫昔芬(三苯氧胺，揚子江藥業(yè))20 mg/d，5 d后B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度及卵泡大小，酌情添加HMG 37.5～75 U/d。當(dāng)卵泡直徑>16 mm，根據(jù)血LH、E2和P水平適時予 HCG 6 000～8 000 U誘導(dǎo)排卵，HCG誘導(dǎo)后第5天行解凍卵裂期胚胎移植，第7天行解凍囊胚移植。HCG誘導(dǎo)后第2天予以黃體酮(黃體酮注射液，浙江仙琚)40 mg qd+地屈孕酮(達(dá)芙通，雅培，荷蘭)10 mg bid轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。

3.胚胎質(zhì)量評估標(biāo)準(zhǔn)

(1)卵裂期胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)胚胎卵裂球大小、形態(tài)、數(shù)目、胞質(zhì)及碎片將胚胎分為4級，Ⅰ級：胚胎卵裂球等大，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)均勻清晰，碎片無或<10%；Ⅱ級：胚胎卵裂球大小不等，形態(tài)欠規(guī)則，碎片在10.0%～25.0%；Ⅲ級：胚胎卵裂球大小不均，碎片在25.1%～50.0%；Ⅳ級：胚胎卵裂球大小不均，碎片>50.0%。Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

(2)囊胚評分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Gardner[6]提出的評價方法對第5天囊胚期胚胎根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵化，將囊胚的發(fā)育分為6個時期。1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎總體積的1/2；2期：囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期：完全擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期：擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變??；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期：孵出的囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。

(3)處于3至6期的囊胚，還需對其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量分級。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級：A級，細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B級，細(xì)胞數(shù)目少，排列松散；C級，細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞分級：A級，上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B級，上皮細(xì)胞層由不多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C級，上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成。其中，評分在3BB以上為優(yōu)質(zhì)囊胚。

三、妊娠結(jié)局判斷及觀察指標(biāo)

移植后14 d檢測血清β-HCG水平，β-HCG陽性者于移植后30 d行陰道B超檢查，見孕囊者判定為臨床妊娠。

觀察指標(biāo)：臨床妊娠率=B超見孕囊例數(shù)/總例數(shù)×100%，種植率=孕囊總數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%，早期流產(chǎn)率=流產(chǎn)例數(shù)/見孕囊例數(shù)×100%，多胎率=多胎例數(shù)/見孕囊例數(shù)×100%，異位妊娠率=異位妊娠例數(shù)/見孕囊例數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

三組患者年齡、不孕年限、體重指數(shù)及基礎(chǔ)FSH均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

二、臨床結(jié)局比較

A組臨床妊娠率、種植率顯著高于對照組(P均<0.05)；B1組種植率顯著高于對照組(P<0.05)。多胎率、早期流產(chǎn)率、異位妊娠率各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表1 各組基本資料

表2 各組臨床結(jié)局比較 [%(n)]

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

體外受精-胚胎移植的成功與胚胎發(fā)育潛能及子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)。子宮內(nèi)膜容受性的建立，子宮內(nèi)膜與胚胎之間相互作用并達(dá)到精確的同步化是胚胎成功植入的關(guān)鍵。子宮內(nèi)膜容受性的建立主要受到雌、孕激素的調(diào)節(jié)。子宮內(nèi)膜局部產(chǎn)生的多種促炎因子、抑炎因子及信號分子，如前列腺素、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、整合素、白血病抑制因子、雌激素和孕激素受體等也參與調(diào)節(jié)雌、孕激素的功能，使子宮內(nèi)膜達(dá)到良好的容受狀態(tài)，為胚胎的生存、植入、分化提供一個適宜的微環(huán)境。胚胎在植入時需要足夠的趨化因子和炎癥細(xì)胞因子在母胎界面調(diào)節(jié)胚胎的侵入能力，保證胚胎成功著床[7-8]。另一方面，早期胚胎源性生長因子、細(xì)胞因子及信號分子可能對改善子宮內(nèi)膜容受性、促進(jìn)胚泡著床并維持妊娠有重要的作用。

Eyheremendy等[9]發(fā)現(xiàn)早期胚胎可以誘使內(nèi)膜進(jìn)入“ 種植窗 ” 狀態(tài)，可能與胚胎能分泌一些生長因子有關(guān)，如IL-1、轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子等，在促進(jìn)胚胎發(fā)育的同時誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜容受性增加。Melnick等[10]比較了子宮內(nèi)膜與胚胎共培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)的胚胎卵裂率和囊胚形成率，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組胚胎的生長情況和囊胚形成率明顯優(yōu)于單獨培養(yǎng)組。Binder 等[11]發(fā)現(xiàn)，在體外子宮內(nèi)膜與胚胎共培養(yǎng)可以改善子宮內(nèi)膜容受性，有利于胚胎生長及著床。以上研究結(jié)論說明子宮內(nèi)膜與胚胎之間的作用是互利的。體外受精與自然受孕不同之處在于胚胎要在體外培養(yǎng)3～5 d，子宮內(nèi)膜缺乏胚源性因子的刺激，內(nèi)膜容受性可能受到影響，特別是對某些本身內(nèi)膜容受性不良的患者影響更大。子宮內(nèi)膜容受性低下也會影響胚胎發(fā)育及胚胎與子宮內(nèi)膜的同步化，從而降低胚胎成功植入的幾率。研究發(fā)現(xiàn)，有30%不孕癥患者存在子宮內(nèi)膜種植窗改變，表現(xiàn)為種植窗提前、推后或縮短[12]。臨床上部分患者RIF的原因可能是整倍體囊胚與植入窗口未同步化[13]。

囊胚移植作為臨床上RIF患者移植策略之一已達(dá)成廣泛共識，其與卵裂期胚胎相比有較大優(yōu)勢。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)：囊胚移植的臨床妊娠率和胚胎種植率明顯高于卵裂期胚胎移植[3]，早期流產(chǎn)率有降低的趨勢[14]，單囊胚移植是降低多胎妊娠風(fēng)險的有效方法[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與卵裂期胚胎相比，單囊胚移植組臨床妊娠率、種植率均有升高的趨勢，而多胎率、早期流產(chǎn)率有降低的趨勢，但差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

對于具有形態(tài)學(xué)“正?！钡膬?nèi)膜及胚胎的RIF患者除了胚胎因素外，更多的原因可能在于子宮內(nèi)膜微環(huán)境的不良，因此從改善子宮內(nèi)膜容受性方面尋找對策成為臨床治療反復(fù)種植失敗的重要突破點。臨床發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜機械性刺激可改善RIF患者的妊娠結(jié)局[15-17]。子宮內(nèi)膜機械刺激作用的機制有以下三方面：(1)子宮內(nèi)膜損傷可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞生長及子宮內(nèi)膜螺旋動脈生成，增加子宮內(nèi)膜血流，促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體的發(fā)育并使基質(zhì)細(xì)胞水腫和蛻膜化從而增加胚胎植入的可能性[18-19]；(2)內(nèi)膜機械性刺激引發(fā)內(nèi)膜炎癥反應(yīng)，可以提高子宮內(nèi)膜局部促炎因子的表達(dá)[20]，而早期胚胎種植在著床部位需要促炎因子的作用，使胚胎易于粘附在子宮內(nèi)膜上，并促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的侵入；(3)基因調(diào)控方面，有研究發(fā)現(xiàn)在RIF患者中子宮內(nèi)膜miRNA表達(dá)異常，包括miR-145，miR-23b和miR-99a的過度表達(dá)以及3種miRNAs的低表達(dá)[21]。子宮內(nèi)膜損傷可能調(diào)控子宮內(nèi)膜基因的miRNA表達(dá)，從而利于胚胎植入[22]。子宮內(nèi)膜機械刺激的主要優(yōu)勢在于改善子宮內(nèi)膜容受性，本研究中內(nèi)膜機械刺激組的不足之處有：(1)選擇囊胚移植，由于胚胎移植過晚，子宮內(nèi)膜缺乏早期胚胎產(chǎn)生的胚源性生長因子、細(xì)胞因子及信號分子的調(diào)節(jié)作用，對某些內(nèi)膜容受性不良的患者可能是無益的；囊胚體外培養(yǎng)存在培養(yǎng)失敗導(dǎo)致無胚胎移植的風(fēng)險。(2)選擇卵裂期胚胎移植，缺乏了通過囊胚移植來挑選胚胎的優(yōu)勢。

近年來研究發(fā)現(xiàn)：在RIF患者新鮮移植周期中，序貫移植組臨床妊娠率明顯高于卵裂期胚胎移植組[4]；在RIF患者凍融胚胎移植周期中，序貫移植組的臨床妊娠率和胚胎種植率均高于單純囊胚移植組；在非RIF患者IVF/ICSI 新鮮周期中發(fā)現(xiàn)序貫移植組的胚胎種植率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率均高于卵裂期胚胎移植組，而流產(chǎn)率低于卵裂期胚胎移植組[10]。序貫移植的優(yōu)勢：(1)第一次移入宮腔的胚胎產(chǎn)生的胚源性因子有助于創(chuàng)造最佳的內(nèi)膜容受性狀態(tài)，促進(jìn)胚胎的發(fā)育及種植，這是內(nèi)膜機械性刺激無法完全替代的；(2)囊胚移植的優(yōu)勢是可以挑選更有發(fā)育潛能的胚胎，囊胚與子宮內(nèi)膜同步性更好，有助于提高胚胎種植率。我們的臨床研究初步顯示，序貫移植組(A組)與內(nèi)膜機械刺激組(B1、B2)相比，臨床妊娠率有升高的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(3)序貫移植可以減少因囊胚培養(yǎng)失敗無胚胎移植的風(fēng)險，增加患者周期妊娠機會。Yazbeck等[23]研究顯示，42%的患者在D5/D6未獲得高質(zhì)量囊胚，僅在D2/D3行單卵裂期胚胎移植，妊娠率為25.3%。本研究中擬序貫移植的患者中有12例囊胚培養(yǎng)失敗，僅行單卵裂期凍融胚胎移植，其臨床妊娠率為16.67%(2/12)。序貫移植的不足之處：(1)本研究結(jié)果顯示，序貫移植組較其他各組相比，多胎率有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Machtinger等[4]研究顯示，序貫移植多胎率達(dá)到50%，與該研究移植胚胎數(shù)目過多有關(guān)(研究組移植1～2枚卵裂期胚胎+1～2枚囊胚)。我們的體會是實施序貫移植一定要嚴(yán)格控制移植胚胎的數(shù)目；對于子宮畸形或瘢痕子宮等特殊人群應(yīng)慎重選擇序貫移植。(2)序貫移植也存在囊胚培養(yǎng)失敗的風(fēng)險，應(yīng)慎重選擇。

綜上所述，我們認(rèn)為RIF患者再次移植需要采取更加積極的策略，需要綜合每一種方法的作用機制及患者的具體情況進(jìn)行決策。總體來說：選擇序貫移植、內(nèi)膜機械性刺激+囊胚移植及囊胚移植三種移植策略均有改善妊娠結(jié)局的趨勢，三者中序貫移植與傳統(tǒng)卵裂期胚胎移植相比，可顯著提高臨床妊娠率及種植率。另外，其可以降低因囊胚培養(yǎng)失敗無胚胎移植的風(fēng)險，但同時可能增加多胎妊娠的風(fēng)險。臨床應(yīng)根據(jù)患者的具體情況及各種方法的利弊選擇個體化移植策略，如薄型內(nèi)膜采用內(nèi)膜機械性刺激可以改善患者的子宮內(nèi)膜容受性從而有助于改善妊娠結(jié)局；對于RIF中的特殊人群(如子宮畸形或瘢痕子宮、低反應(yīng)、宮腔粘連分離術(shù)后患者等)，由于序貫移植有可能增加多胎妊娠的風(fēng)險，遂要慎重選擇，可以選擇有效性及安全性兩方面均有兼顧的內(nèi)膜機械刺激法結(jié)合單囊胚移植方案。