草甘膦對菱生長、光合色素和抗氧化酶系統(tǒng)的影響蔡歡

吳中華

【摘 要】草甘膦是目前世界范圍內(nèi)使用范圍最廣、用量最大的廣譜、滅生性除草劑。因其被大量利用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，不僅在土壤中存在殘留，同時在水環(huán)境中檢出率也很高，對水生生態(tài)系統(tǒng)帶來一定威脅。本研究通過模擬實(shí)驗(yàn)，選取水生植物菱（Trapa bispinosa Roxb.）于不同濃度（0，0.05，，0.1，0.3 mmol/L）的水環(huán)境中培養(yǎng)14天后，測定其生長、光和色素含量以及抗氧化酶活性等指標(biāo)，以觀測水體中草甘膦對菱的生態(tài)毒理作用。

【關(guān)鍵詞】草甘膦；水生植物；抗氧化酶系統(tǒng)；菱

草甘膦是目前世界上使用范圍最廣的農(nóng)藥，因其對雜草的毒害具有相對非選擇性，對深根多年生草本植物，莎草和闊葉雜草的去除都非常有效，所以常被用于農(nóng)田和非耕地的除雜用（Annett et al.，2014）。草甘膦主要是通過噴施在植物葉面之后被植物內(nèi)吸后，積累于植物地上的分生組織，抑制5一烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶，可以防止氨基酸苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成，使植物不能合成它生存所必需的某些芳香氨基酸，導(dǎo)致植物次生代謝和蛋白合成反應(yīng)失衡（Bai & Ogbourne，2016；Zhong et al.，2018a；張合彩等，2018），以及莽草酸合成途徑受阻，具有受損的莽草酸代謝的植物易患各種植物病原體，植物最終死亡（范甜甜等，2017）。

草甘膦被大量使用后，其殘留物通過雨水、排灌、地表徑流以及直接排放（被用于水田雜草的去除）等方式進(jìn)入水體，在水體中檢出率很高，影響水生生態(tài)系統(tǒng)（Borggaard & Gimsing，2008）。草甘膦進(jìn)入土壤大多被土壤吸附，但在水體環(huán)境中較難分解，對水生環(huán)境帶來嚴(yán)重威脅。本研究通過模擬實(shí)驗(yàn)，對菱進(jìn)行不同濃度的草甘膦水溶液培養(yǎng)后，測定其生長指標(biāo)、光合色素含量及各抗氧化酶活性，以觀測草甘膦對水生植物菱的生長、生理影響，為后續(xù)治理和修復(fù)工作提供參考。

1.材料和方法

（1）實(shí)驗(yàn)材料

菱，雙子葉植物綱，桃金娘目，菱科、菱屬的一年生水生浮水草本植物。本實(shí)驗(yàn)所用植物采自湖北省武漢市東湖水域。

（2）實(shí)驗(yàn)方法

①實(shí)驗(yàn)處理

將取得植株用自來水徹底清洗，去除黃葉爛葉后以10%霍格蘭營養(yǎng)液進(jìn)行7天馴化，之后取生長狀況良好、大小相近的植物（并記錄初始鮮重）按實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置（0，0.05，0.1，0.3mmol/L）進(jìn)行培養(yǎng)，14天后收獲，測定各項(xiàng)指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)所使用的草甘膦均為純度≥95%的原藥粉劑。

②植物鮮重的測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束采集樣品后，使用蒸餾水對其表面進(jìn)行沖洗，去除附著物，擦干水分后用萬分天平（精確度0.1mg）稱量植株驗(yàn)后鮮重（FW）。

③葉綠素含量測定

光合色素測定參考Jampeetong 和 Brixl （2009）方法加以調(diào)整，取0.1g植物葉片剪碎，放入試管中，加入10mL95%乙醇，密封置于黑暗中24h，用紫外分光度計(jì)測定470，649 和 665nm的吸光值，根據(jù)Lichtenthaler 和 Wellburn （1983）的方法計(jì)算植物葉片中的葉綠素a、b以及類胡蘿卜素含量（mg/g FW）。

④MDA及H2O2含量測定

MDA含量（mmol/g FW）用硫代巴比妥酸（TBA）法測定（王學(xué)奎&黃見良，2015）。

H2O2含量的測定，采用紫外分光光度法測定，參照Patterson等（1984）?？扇苄缘鞍缀繙y定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定（mg/g FW）（Bradford，1976），以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

⑤游離脯氨酸含量測定

游離脯氨酸含量的測定則是使用快速比色法（Bates等，1973）。

⑥抗氧化酶活性測定

取植物葉片0.1g加入50mMPBSpH7.8（內(nèi)含1%PVP）在冰浴下研磨， 在冷凍離心機(jī)下10000g離心10min（施海濤，2016），收集上清液，即為粗酶液，置于4℃環(huán)境中保存，用于后續(xù)指測定。

過氧化氫酶（CAT）活性采用分光光度法，以1min內(nèi)吸光值A(chǔ)240減少0.1的酶量為一個酶活單位（U），酶活性U/（g·min FW）表示（蒼晶&趙會杰，2013）。過氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測定，在560 nm處測定，以抑制NBT光化還原的50%定義為一個SOD酶活性單位?？箟难徇^氧化物酶（APX）是以抗壞血酸作為電子供體，將H2O2還原為H2O。測定時以加入H2O2為起始點(diǎn)，1 min內(nèi)反應(yīng)液在290nm波長下變化0.01為一個APX酶活力單位。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）相對生長率

菱在無草甘膦加入的對照組中，鮮重稍有增加。在低濃度（0.05mmol/L）草甘膦脅迫下，植物鮮重增加，相對生長率顯著上升（p=0.001）。隨著草甘膦濃度的上升，在中高濃度下植株鮮重均出現(xiàn)了負(fù)增長的現(xiàn)象，與對照組相比，高濃度草甘膦（0.3mmol/L）相對生長率顯著下降（p<0.001）。

（2）光合色素含量

和對照組相比，低濃度草甘膦環(huán)境下菱的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均顯著提高（p<0.01），與植物鮮重表現(xiàn)一致，尤其是高濃度草甘膦脅迫下植物光合色素含量與對照組相比表現(xiàn)出一定下降，其中葉綠素b受影響最明顯，降至對照組含量的57%。

（3）MDA、H2O2、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量

MDA含量是衡量細(xì)胞膜脂過氧化水平的主要標(biāo)志之一，草甘膦培養(yǎng)14天后，植物體內(nèi)MDA含量顯著上升。而植物體內(nèi)H2O2含量不因草甘膦的加入而受到明顯影響，其含量與對照組無顯著差異。菱的可溶性蛋白含量變化如表1.中所示，隨著草甘膦的加入有下降的趨勢，但在低濃度環(huán)境下并未達(dá)到顯著水平，在中高濃度草甘膦脅迫下，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量顯著降低。與對照組相比，游離脯氨酸含量受草甘膦的影響而下降，其中在高濃度下，下降水平達(dá)極顯著。

（4）抗氧化酶活性

如圖1.a，菱體內(nèi)CAT活性因草甘膦的加入而下降，且下降程度與草甘膦濃度正相關(guān)。與對照組相比，CAT活性下降在高濃度草甘膦環(huán)境下達(dá)到顯著水平（p=0.005）。圖3.b所示為植物SOD活性變化，草甘膦對SOD活性影響顯著，其中在低濃度水平下表現(xiàn)最為明顯，在中高濃度脅迫下，酶活性下降幅度有所減緩。中低濃度的草甘膦能夠刺激菱體內(nèi)APX活性提高，但隨著草甘膦濃度的進(jìn)一步上升，APX活性明顯下降，顯著低于對照組水平。

3. 討論

在2016 年全球農(nóng)化行業(yè)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)中，草甘膦在全球除草劑市場中占比約 48%，是我國最大的農(nóng)藥品種，也是全球用量最大的農(nóng)藥品種（楊斌，2017）。因其大量使用，所以引起了多方面對其毒性的研究。在低濃度的草甘膦處理下，菱的生長和色素含量均有一定的提高，可能是由于在植物收到一定脅迫下表現(xiàn)出來的應(yīng)激性，以平衡外界環(huán)境帶來的機(jī)體損傷。但在高濃度條件下，植物的葉綠素水平較對照組明顯下降。許多研究表明，草甘膦可以顯著降低植物葉綠素含量（Saunders，Pezeshki，2014），草甘膦對葉綠素含量的影響是影響葉綠素的合成和加速葉綠素降解。其中葉綠素b表現(xiàn)最為明顯，僅降至對照組含量的57%。有研究表明，葉綠素b的含量降低會影響植物體內(nèi)光系統(tǒng)的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致光合作用的反應(yīng)過程失衡，降低植物的對脅迫的耐受性。這表明，草甘膦對菱的脅迫途徑之一可能是通過影響植物體內(nèi)葉綠素b含量從而降低光合作用效率，導(dǎo)致植物死亡（Zhong et al.，2018b）。

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，是衡量細(xì)胞膜受損程度的生物指標(biāo)。在本研究中，MDA含量在三種濃度的草甘膦脅迫下均顯著提高，說明草甘膦對菱的毒害作用明顯，僅低濃度就能對其膜脂帶來明顯傷害。H2O2含量可以衡量植物受脅迫的情況，但在本實(shí)驗(yàn)中，H2O2含量在各草甘膦水平下均無明顯變化，這可能是由于抗氧化系統(tǒng)的各種酶被激活，及時清楚了由于植物應(yīng)激產(chǎn)生的過量H2O2。

SOD、CAT和APX是植物抗氧化系統(tǒng)中的主要保護(hù)酶，SOD是該保護(hù)系統(tǒng)中的第一道防線，可催化超氧陰離子自由基（O2-）歧化形成H2O2和O2（Wu等，2010），CAT和APX的主要功能這是清除植物體內(nèi)多余的H2O2。在本實(shí)驗(yàn)中，APX活性在中低草甘膦濃度條件下顯著提高，承擔(dān)了大量植物體內(nèi)H2O2的清除工作，Gomes和Juneau（2016）觀察到草甘膦處理可以使浮萍積累MDA和H2O2，APX酶活性提高以平衡此種損傷。而CAT和SOD活性在草甘膦脅迫環(huán)境下顯著降低，這可能是由于植物體內(nèi)H2O2含量在脅迫環(huán)境下并沒有顯著上升，不足以刺激機(jī)體酶活性提升，同時在脅迫作用下，菱的CAT和SOD在該種脅迫作用下易被破壞。

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