不同產(chǎn)地海帶脂肪酸組成的比較分析

徐 華 張 茹 張進(jìn)杰 樓喬明 楊文鴿 徐大倫

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

海帶(Luminariajaponica)又名昆布、江白菜、海帶菜，為褐藻門(Phaeophyta)褐子綱(Phaeosporae)海帶目(Laminariales)的一種大型海藻[1-2]。海帶在我國有著悠久的食用歷史，其含有豐富的褐藻酸、甘露醇、膳食纖維，以及維生素和礦物質(zhì)等活性成分，是一種天然的低脂肪低熱量的保健食品，符合現(xiàn)代人的飲食結(jié)構(gòu)[3]。近年來，隨著藥理和臨床研究的不斷深入，海帶在調(diào)節(jié)血糖、降血脂、預(yù)防心腦血管疾病，以及防癌抗癌和提高免疫力等功效方面日益受到重視[4-6]。

目前，海帶是我國養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量最大的海洋經(jīng)濟(jì)藻類，為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一，其養(yǎng)殖范圍北起遼寧，南至福建、廣東沿岸；2015年我國海帶產(chǎn)量已達(dá)141萬t，居世界首位[7-8]。國內(nèi)外對(duì)海帶的研究和開發(fā)主要集中于多糖[9-11]、多酚[12]和蛋白質(zhì)等活性成分[13]，對(duì)海帶脂肪酸組成和多不飽和脂肪酸提取亦有報(bào)道[14-15]，但對(duì)不同產(chǎn)地海帶脂肪酸組成的比較分析尚未見報(bào)道。海帶總脂含量低、脂質(zhì)組成復(fù)雜，且富含多不飽和脂肪酸，因此，如何有效提取海帶總脂，并對(duì)脂肪酸進(jìn)行色譜分析是準(zhǔn)確分析海帶總脂脂肪酸組成的關(guān)鍵所在。本研究采用溶劑法對(duì)福州、寧波和青島3個(gè)產(chǎn)地海帶的總脂進(jìn)行提取優(yōu)化，并采用酸甲酯化衍生和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對(duì)3個(gè)產(chǎn)地海帶總脂的脂肪酸組成進(jìn)行比較分析，以期為海帶的脂肪酸分析、營養(yǎng)評(píng)價(jià)，以及海帶的精深加工和產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干制海帶分別購自福州、寧波和青島當(dāng)?shù)厥袌觯?7種脂肪酸甲酯混標(biāo)和魚油脂肪酸甲酯混標(biāo)，購自美國Sigma公司；二氯甲烷、甲醇、正己烷、異丙醇、甲基叔丁基醚等分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

6980N氣相色譜儀、5973質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；SER148/6型脂肪測定儀，意大利VELP公司；Laborota 4000 efficient型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國Heidolph公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海帶預(yù)處理 干制海帶表面經(jīng)清理，去除雜質(zhì)和殘葉，經(jīng)粉碎制成海帶粉，放于4℃冰箱中備用。

1.2.2 海帶總脂的提取 二氯甲烷-甲醇法[16-17]：稱取10 g海帶粉，加入200 mL二氯甲烷-甲醇混合液(2∶1，v∶v)，超聲振蕩30 min，并浸提3 h；抽濾后，濾液用50 mL 0.9%氯化鈉溶液洗滌分層，收集二氯甲烷層，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到海帶總脂。

正己烷-異丙醇法[18-19]：稱取10 g海帶粉，加入200 mL正己烷-異丙醇混合液(3∶2，v∶v)，超聲振蕩30 min，并浸提3 h。抽濾后，濾液用80 mL 5%硫酸鈉溶液洗滌分層，收集正己烷層，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到海帶總脂。

甲基叔丁基醚法[20]：稱取10 g海帶粉，依次加入60 mL甲醇和200 mL甲基叔丁基醚，超聲振蕩30 min，并浸提3 h；抽濾后，濾液用50 mL蒸餾水洗滌分層，收集甲基叔丁基醚層，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到海帶總脂。

索氏提取法：稱取10 g海帶粉，放入濾紙筒中，用100 mL石油醚(沸程30～60℃)于75℃加熱抽提3 h；抽提結(jié)束后，石油醚提取液經(jīng)減壓濃縮得到海帶總脂。

1.2.3 甲酯化衍生 參照樓喬明等[21]的方法。稱取10 mg海帶總脂，加入1 mL 10%濃硫酸-甲醇溶液，于60℃水浴中甲酯化15 min，冷卻后加入1 mL正己烷振蕩，靜置分層后，取上清液供GC-MS分析。

1.2.4 脂肪酸檢測 色譜條件：HP-INNOWax石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，載氣為高純氦氣，采用恒壓模式，壓力54 kPa，分流比25∶1；進(jìn)樣口溫度230℃，檢測器溫度250℃，柱溫以3℃·min-1的升溫速率由140℃升至210℃，并于210℃保持7 min，整個(gè)分析過程為30 min。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度280℃，EI離子源, 電離能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描周期2.84次·s-1，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～500 u。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每次試驗(yàn)平行測定3次，利用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析法(ANOVE，Tukey檢驗(yàn))進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并通過Duncan′s法進(jìn)行單因素多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法對(duì)海帶總脂提取效果的影響

由表1可知，二氯甲烷-甲醇法提取的海帶總脂含量較高，其中青島產(chǎn)地的總脂含量最高，占海帶干重的0.86%，福州(0.75%)和寧波(0.69%)次之；索氏提取法和甲基叔丁基醚法提取的海帶總脂含量低于二氯甲烷-甲醇法，且正己烷-異丙醇法提取的海帶總脂含量顯著低于二氯甲烷-甲醇法(P<0.05)。

表1 不同方法提取的海帶總脂含量

注：不同小寫字母表示同一產(chǎn)地不同方法間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase mean significant difference among different methods in the same origin at 0.05 level.

2.2 不同產(chǎn)地海帶脂肪酸的比較分析

3個(gè)產(chǎn)地海帶總脂經(jīng)二氯甲烷-甲醇法提取，采用酸甲酯化衍生和氣相色譜-質(zhì)譜分析，取得了理想的色譜分離效果，其總離子流色譜圖見圖1。通過標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照、質(zhì)譜特征分析、數(shù)據(jù)庫檢索和等碳鏈長值等多種方法進(jìn)行綜合鑒定分析[22-24]，從海帶總脂中共鑒定出30種脂肪酸(表2)。

海帶脂肪酸由C14-C20脂肪酸組成，且以C14：0、C16：0、C18：1n-9、C18：2n-6、C18：4n-3、C20：4n-6(AA)和C20：5n-3(EPA)為主。在所鑒定出的12種飽和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)中，以直鏈飽和脂肪酸為主，其中C16：0含量最高，占到脂肪酸總量的23.44%～24.32%；其次為C14：0，福州產(chǎn)地海帶中C14：0含量為7.92%，遠(yuǎn)高于寧波(7.02%)和青島(6.48%)且差異顯著(P<0.05)；海帶中C18：0和C20：0含量較低，分別僅占脂肪酸總量的0.54%～1.05%和0.37%～0.47%。同時(shí)，從海帶總脂脂肪酸中鑒定出6種單支鏈飽和脂肪酸，包括3種異式脂肪酸和3種反異式脂肪酸，占脂肪酸總量的1.29%～1.84%。

海帶總脂中單不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)7種，以C18：1n-9、C16：1n-7和C16：1n-9為主；C18：1n-9為海帶總脂中含量最高的單不飽和脂肪酸，其中青島產(chǎn)地海帶中C18：1n-9含量為19.11%，顯著高于福州(17.34%)和寧波(18.11%)。單不飽和脂肪酸中C16：1n-7和C16：1n-9含量次之，寧波產(chǎn)地海帶中C16：1n-7含量為4.09%，高于福州(3.75%)和青島(3.32%)且差異顯著(P<0.05)；青島產(chǎn)地海帶中C16：1n-9含量為2.96%，遠(yuǎn)高于寧波(2.68%)和福州(0.71%)且差異顯著(P<0.05)。

海帶總脂中多不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)11種，以C18：2n-6、C18：4n-3、C20：4n-6(AA)和C20：5n-3(EPA)為主。對(duì)比3個(gè)產(chǎn)地海帶的多不飽和脂肪酸發(fā)現(xiàn)：福州產(chǎn)地海帶中的C20：4n-6(AA)和C18：2n-6含量分別為10.12%和8.76%，高于寧波(9.41%、6.57%)和青島(8.77%、5.40%)且差異顯著(P<0.05)；C20：5n-3(EPA)(6.18%)顯著低于寧波(8.13%)和青島(9.40%)。

在脂肪酸定性定量分析的基礎(chǔ)上，對(duì)3個(gè)產(chǎn)地海帶的主要脂肪酸類型進(jìn)行比較分析(表3)。3個(gè)產(chǎn)地海帶中的飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量較為接近，分別為34.17%～36.16%和37.42%～39.82%，且均顯著高于單不飽和脂肪酸含量(24.02%～27.83%)。福州產(chǎn)地海帶中的n-3 PUFA含量為14.86%，顯著低于寧波(17.72%)和青島(18.75%)；n-6 PUFA含量為23.98%，顯著高于寧波(19.43%)和青島(18.20%)，使得福州產(chǎn)地海帶的n-3/n-6比值顯著低于寧波(0.91)和青島(1.03)。C20：4n-6和C20：5n-3為海帶重要的多不飽和脂肪酸，福州產(chǎn)地海帶中兩者脂肪酸總含量(EPA+AA)為16.30%，顯著低于寧波(17.54%)和青島(18.17%)；福州產(chǎn)地海帶中兩者多不飽和脂肪酸比值(EPA/AA)僅為0.61，亦顯著低于寧波(0.86)和青島(1.07)。

序號(hào)Number保留時(shí)間Retention time/min脂肪酸Fatty acid產(chǎn)地 Origin福州 Fuzhou寧波 Ningbo青島 Qingdao13.32iso-C14:00.27±0.02b0.20±0.03a0.35±0.03c23.59anteiso-C14:00.10±0.03a0.13±0.02a0.20±0.02b33.80C14:07.92±0.21c7.02±0.25b6.48±0.16a44.09C14:1n-50.22±0.03b0.14±0.03a0.32±0.02c54.47iso-C15:00.16±0.02a0.22±0.03b0.18±0.03ab64.74anteiso-C15:00.26±0.02b0.19±0.02a0.27±0.03b74.99C15:01.06±0.04c0.57±0.03a0.64±0.02b86.16anteiso-C16:00.48±0.02b0.38±0.03a0.41±0.02a96.53C16:024.04±0.43a24.32±0.57a23.44±0.51a106.81C16:1n-90.71±0.05a2.68±0.09b2.96±0.08c116.88C16:1n-73.75±0.14b4.09±0.17c3.32±0.11a127.35C16:2n-40.98±0.03b0.27±0.02a1.16±0.03c138.26C17:00.29±0.03a0.55±0.03c0.35±0.02b148.63C17:1n-70.74±0.05a0.98±0.04b0.81±0.04a159.31iso-C18:00.36±0.02b0.17±0.02a0.43±0.02c1610.26C18:00.75±0.06b0.54±0.03a1.05±0.04c1710.61C18:1n-917.34±0.37a18.11±0.42a19.11±0.37b1810.74C18:1n-70.22±0.01a0.62±0.03c0.48±0.02b1911.52C18:2n-68.76±0.19c6.57±0.16b5.40±0.13a2012.12C18:3n-63.61±0.05c3.02±0.11a3.35±0.06b2112.87C18:3n-32.88±0.07a3.13±0.08b2.76±0.05a2213.50C18:4n-35.13±0.14a5.77±0.19c5.43±0.09b2314.67C20:00.47±0.03b0.46±0.03b0.37±0.02a2414.85C20:1n-91.04±0.05b1.21±0.05c0.72±0.04a2515.34C20:2n-60.97±0.04c0.19±0.02a0.26±0.03b2616.04C20:3n-60.52±0.03c0.24±0.02a0.42±0.02b2716.58C20:3n-30.26±0.02a0.25±0.02a0.59±0.02b2817.05C20:4n-6(AA)10.12±0.28c9.41±0.35b8.77±0.25a2918.03C20:4n-30.41±0.02a0.44±0.02a0.57±0.02b3018.51C20:5n-3(EPA)6.18±0.14a8.13±0.22b9.40±0.27c

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；AA：二十碳四烯酸；EPA：二十碳五烯酸。下同。

Note: Different lowercase in the same line mean significant difference at 0.05 level. AA: Arachidonic acid. EPA: Eicosapentaenoic acid. The same as following.

3 討論

海帶營養(yǎng)成分以褐藻膠、甘露醇、粗纖維、蛋白質(zhì)及無機(jī)鹽等礦物質(zhì)元素為主，總脂含量較低[25-26]，且海帶總脂含有甘油酯、磷脂和糖脂等多種脂質(zhì)成分，組成復(fù)雜[27]?？傊崛≈饕揽坑袡C(jī)溶劑的極性和溶解性，正己烷-異丙醇法、甲基叔丁基醚法和索氏提取法所涉及的提取溶劑依次為正己烷、甲基叔丁基醚和石油醚，這些有機(jī)溶劑的極性和溶解性均較弱，上述3種提取方法適用于總脂含量高且以甘油酯為主的樣品，因此，對(duì)總脂含量低且脂質(zhì)組成復(fù)雜的海帶樣品不能進(jìn)行完全有效提取，致使海帶總脂提取量較低。同時(shí)，索氏提取法提取溫度高，易破壞海帶總脂中的不飽和脂肪酸，降低不飽和脂肪酸含量，故正己烷-異丙醇法、甲基叔丁基醚法和索氏提取法不適用于海帶總脂的提取。本研究結(jié)果表明，二氯甲烷-甲醇法能對(duì)海帶總脂進(jìn)行有效提取，提取量高于正己烷-異丙醇法、甲基叔丁基醚法和索氏提取法，且其操作簡單，試劑毒性較低，是海帶總脂提取的理想方法。

表3 不同產(chǎn)地海帶脂肪酸的類型比較Table 3 Classification comparison of fatty acids of Laminaria japonica from different origins

甲酯化衍生是氣相色譜-質(zhì)譜法分析脂肪酸組成的重要預(yù)處理過程。目前，常用的甲酯化衍生方法有酸甲酯化法和堿甲酯化法，堿甲酯化法只適用于結(jié)合型脂肪酸，酸甲酯化法既適用于結(jié)合型脂肪酸，亦適用于游離型脂肪酸[14]。海帶脂質(zhì)組成復(fù)雜，脂肪酸常以甘油三酯、糖脂、磷脂和游離脂肪酸等多種形式存在，故酸甲酯化法更適合于海帶脂肪酸的甲酯化衍生。同時(shí)，通過對(duì)脂肪酸甲酯結(jié)構(gòu)特征分析和已有文獻(xiàn)[14, 28]比較，極性毛細(xì)管柱更適合于海帶脂肪酸組成分析。本研究采用極性毛細(xì)管柱(HP-INNOWax)優(yōu)化程序升溫條件，取得了理想的色譜分離效果。

海帶中的單不飽和脂肪酸以C18：1n-9為主，占總脂肪酸含量的17.34%～19.11%。C18：1n-9能有效降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量，亦能有效減少機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，降低機(jī)體的過度性炎癥反應(yīng)，有助于機(jī)體康復(fù)[29]。海帶多不飽和脂肪酸以C18-PUFA和C20-PUFA為主，其中C20：4n-6、C20：5n-3為海帶等褐藻的標(biāo)志性多不飽和脂肪酸。本研究中，海帶總脂脂肪酸組成中未檢測出C22：6n-3(DHA)，這與前人報(bào)道結(jié)果一致[30-31]。此外，福州、寧波、青島3個(gè)產(chǎn)地海帶中的C20：4n-6(AA)和C20：5n-3(EPA)存在顯著差異，致使n-3 PUFA、n-6 PUFA、n-3/n-6、EPA+AA和EPA/AA等指標(biāo)也存在顯著差異，這可能與海帶生長所處海域的水溫、光照和緯度等有一定相關(guān)性[32-33]。C20：4n-6(AA)為重要的n-6型多不飽和脂肪酸，是前列腺素E2、前列環(huán)素、血栓烷素A2和白細(xì)胞三烯等二十碳酸衍生物的直接前體，能有效調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，激活調(diào)節(jié)血小板和白細(xì)胞功能活性，在預(yù)防、治療炎癥等方面發(fā)揮重要作用[34-35]。C20：5n-3(EPA)屬于n-3多不飽和脂肪酸，其能促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、改善大腦功能、提高記憶力，并能有效調(diào)節(jié)血脂和血糖，預(yù)防血栓、動(dòng)脈硬化等心腦血管疾病[36-37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，海帶中C20：4n-6和C20：5n-3的總量高達(dá)16.30%～18.17%，說明海帶可作為有效的膳食來源補(bǔ)充人體所需的C20：4n-6、C20：5n-3等多不飽和脂肪酸。

4 結(jié)論

二氯甲烷-甲醇法的總脂提取效率高于正己烷-異丙醇法、甲基叔丁基醚法和索氏提取法，是海帶總脂提取的有效方法。同時(shí)，酸甲酯化(10%濃硫酸-甲醇溶液)和極性毛細(xì)管柱(HP-INNOWax)更適合于海帶脂肪酸的甲酯化衍生和氣相色譜分析。福州、寧波和青島3個(gè)產(chǎn)地海帶經(jīng)二氯甲烷-甲醇法提取，其總脂含量依次為0.75%、0.69%和0.86%，且3個(gè)產(chǎn)地間無顯著差異。通過酸甲酯化衍生和氣相色譜-質(zhì)譜分析從海帶總脂中共鑒定出30種脂肪酸，以C16：0、C18：1n-9、C20：4n-6(AA)和C20：5n-3(EPA)為主，且3個(gè)產(chǎn)地海帶在脂肪酸上存在顯著差異。福州產(chǎn)地海帶中C20：4n-6(AA)顯著高于寧波和青島，而C20：5n-3(EPA)顯著低于寧波和青島，致使3個(gè)產(chǎn)地海帶中的n-3 PUFA、n-6 PUFA、n-3/n-6、EPA+AA和EPA/AA等指標(biāo)存在顯著差異。本研究結(jié)果為海帶脂肪酸分析、營養(yǎng)評(píng)價(jià)，以及海帶的精深加工和產(chǎn)品開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。