基于線粒體Cyt b DNA阿拉善馬鹿分子系統(tǒng)學(xué)研究

喬付杰 李俊樂(lè) 高 惠 滕麗微，2 王繼飛 劉振生，2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱，150040；3.寧夏賀蘭山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，銀川，750021)

阿拉善馬鹿(Cervuselaphusalxaicus)是馬鹿(C.elaphus)的一個(gè)亞種，為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物[1]。馬鹿屬偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Ceridae)鹿亞科(Cervinae)，我國(guó)分布有8個(gè)馬鹿亞種，分別為天山亞種(C.e.songaricus)、塔里木亞種(C.e.yarkandensis)、阿爾泰亞種(C.e.sibiricus)、甘肅亞種(C.e.kansuensis)、阿拉善亞種(C.e.alxaicus)、四川亞種(C.e.macneilli)、西藏亞種(C.e.wallichi)和東北亞種(C.e.xanthopygus)[2]。阿拉善馬鹿目前僅分布于寧夏和內(nèi)蒙古交界的賀蘭山中段，是我國(guó)唯一幸存的該亞種的有效種群[2-4]，劉振生等[5-6]和駱?lè)f等[7]已對(duì)賀蘭山地區(qū)阿拉善馬鹿的生境選擇進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，高惠等就該地區(qū)阿拉善馬鹿的生境適宜性做了評(píng)價(jià)[8]。但目前關(guān)于野生阿拉善馬鹿的分子研究尚屬空白。

線粒體DNA是母系遺傳，具有分子量小，進(jìn)化速度快等特點(diǎn)。其Cytb區(qū)基因的進(jìn)化速度適中，一個(gè)較小的基因片段就包含著從種內(nèi)到種間的遺傳進(jìn)化信息[9]，對(duì)種群遺傳多樣性有很重要的作用。本文對(duì)采自賀蘭山的野生阿拉善馬鹿糞便樣本進(jìn)行DNA提取、線粒體Cytb區(qū)DNA序列測(cè)定和分析，分析該物種的遺傳變異和其他中國(guó)分布的馬鹿亞種的遺傳分化，為其遺傳多樣性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)該物種的合理管護(hù)、促進(jìn)種群發(fā)展具有重要意義。

1 研究地概況

賀蘭山位于寧夏回族自治區(qū)和內(nèi)蒙古自治區(qū)交界處(38°21′—39°22′ N，105°49′—106°42′ E)，由內(nèi)蒙古賀蘭山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和寧夏賀蘭山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)組成。海拔一般為2 000—3 000 m，為典型的大陸性氣候，植被依據(jù)海拔的上升呈明顯的垂直分異，自下而上依次為山地草原帶(1 400—1 600 m)，山地疏林草原帶(1 600—2 000 m)，山地針葉林帶(1 900—3 000 m)，亞高山灌叢和草甸帶(3 000—3 556 m)[10]。

2 材料與方法

2.1 樣品采集與DNA提取

在2016年8—9月和2017年2—3月在賀蘭山地區(qū)采集馬鹿野生群體的新鮮糞便樣本396份(圖1)。采集時(shí)使用一次性PE手套，防止交叉污染，并用手持GPS定位。采集的糞便倒入無(wú)水乙醇保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后冷凍保存。使用QIAGEN QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 試劑盒提取DNA，具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)試劑盒詳細(xì)使用說(shuō)明書(shū)，將提取好的DNA分成兩份，一份放置于-20℃用于下一步的擴(kuò)增使用，一份放置于-80℃凍存。

圖1 研究區(qū)域與采樣點(diǎn)Fig.1 Study area and sampling points

2.2 物種鑒定

PCR擴(kuò)增線粒體Cytb區(qū)全序列。引物為上游：5′-GAAAAACCATCGTTGTCATTCA-3′；下游5′-GGAGGTTGGTAGCTCTCCTTTT-3′[11]，擴(kuò)增片段大小約1 200 bp。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為25 μL，按順序分別將2×PCR buffer for KOD FX Neo 12.5 μL，2 Mm dNTPs 5 μL，10 pmol/μL上游引物 0.75 μL，10 pmol/μL下游引物0.75 μL，PCR grade water 3.5 μL，模板DNA 1.5 μL，KOD FX NEO(1.0 OU/L)1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后在68℃再延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物公司純化并雙向測(cè)序，測(cè)序引物為擴(kuò)增引物。

2.3 個(gè)體識(shí)別

經(jīng)物種識(shí)別確定后的馬鹿糞便樣品使用多態(tài)性較高的9對(duì)微衛(wèi)星引物CSSM19、BM1818、T501、BM3628、T530、RT1、DM45、HAUT14、T156[12-16]進(jìn)行基因分型分析，共篩選得到糞便DNA質(zhì)量較高的297份樣本，識(shí)別出278個(gè)阿拉善馬鹿個(gè)體，并用于后續(xù)的種群遺傳多樣性研究。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Bioedit 7.0.5.3[17]對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行排列對(duì)比并輔以人工校對(duì)，用DNASP 5.00.07[18]計(jì)算核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)和單倍型多樣性(Haplotype diversity，h)，以對(duì)馬鹿種群的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估，用MEGA 7.0.26[19-21]和MrBayes v3.2.6[22]以梅花鹿(C.nippon)序列(登錄號(hào)：AB211429)作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Network 5.00.3[23]以 Median-joining 法構(gòu)建各單倍型之間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并對(duì)圖中各個(gè)單倍型進(jìn)行群體對(duì)應(yīng)關(guān)系分析。

3 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增出107個(gè)阿拉善馬鹿Cytb區(qū)基因全序列，序列長(zhǎng)1 075 bp，堿基T的平均含量為29.38%，堿基C的平均含量為26.69%，堿基A的平均含量為30.31%，堿基G的平均含量為13.62%，A+T的平均含量為59.68%，顯著高于C+G的平均含量40.32%。因此阿拉善馬鹿線粒體Cytb區(qū)富含堿基A和T并反G偏歧。說(shuō)明堿基含量具有一定的偏歧性，符合哺乳動(dòng)物堿基組成比例。

在獲得的1 075 bp全序列中，保守位點(diǎn)有1 065個(gè)，變異位點(diǎn)有10個(gè)，均為堿基置換無(wú)插入缺失，其中單突變位點(diǎn)7個(gè)，簡(jiǎn)約變異位點(diǎn)3個(gè)，占分析位點(diǎn)的0.93%。單突變位點(diǎn)5、15、47、174、253、389、1 038，保守位點(diǎn)11、1 039、1 040。共定義了10個(gè)單倍型，其中有93個(gè)個(gè)體共享1個(gè)單倍型，6個(gè)個(gè)體共享1個(gè)單倍型，其他單倍型均為獨(dú)有的。單倍型多樣性(h=0.243)，核苷酸多樣性(π=0.000 32)。中性檢驗(yàn)得到Tajima’sD值為-2.073 91(P<0.005)，F(xiàn)u and Li’sD值為-3.610 35(P<0.02)。

基于本研究的序列數(shù)據(jù)(Hap_1—Hap_10)與從 GenBank 中檢索獲得的 15條近緣馬鹿群體(Hap_11—Hap_24)的線粒體CytbDNA全序列，采用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(Kimura 2-parameter model)通過(guò)1 000次的自舉檢驗(yàn)估計(jì)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)構(gòu)建中節(jié)點(diǎn)(圖2)，用Modeltest 3.7分析得到最佳模型HKY+I(-lnL=2 007.419 2，AIC=4 024.838 4)，馬爾科夫鏈的蒙特卡洛法(MCMC)運(yùn)行100萬(wàn)代，取樣頻率為100代，丟棄25%老化值(burnin samples)(圖3)。登錄號(hào)：東北馬鹿：AB021097(共享Hap_1)、AF423197(Hap_11)、GU457434(Hap_12)、JF893493(Hap_13)、KM410148(Hap_14)、JF893494(Hap_15)；天山馬鹿：HQ191429(Hap_16)、KJ025072(Hap_17)、KF781108(Hap_18)、KF781115(Hap_19)、KF781114(Hap_20)；西藏馬鹿：AY044861(Hap_21)；四川馬鹿：AY035875(Hap_22)；甘肅馬鹿：AY070223(Hap_23)、AB021098(Hap_24)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這24個(gè)單倍型分為明顯的2支，阿拉善馬鹿線粒體CytbDNA單倍型聚為一個(gè)單系，與東北馬鹿親緣關(guān)系較近。依據(jù) Network 軟件以中接法(Median-joining)構(gòu)建的單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示(圖 4)，Hap_1—Hap_10大部分單倍型之間經(jīng)過(guò)一步突變，Hap_1做為阿拉善馬鹿祖先單倍型。單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步支持了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析，阿拉善馬鹿10個(gè)單倍型與其他引用的單倍型明顯分離形成兩個(gè)類群。

圖2 使用鄰接法構(gòu)建的24個(gè)單倍型的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from the 24 Cyt b haplotypes

圖3 基于線粒體Cyt b區(qū)單倍型構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 MrBayes phylogenetic tree constructed from the 24 Cyt b haplotypes

圖4 24個(gè)單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig.4 Network relationship of the 24 haplotypes

4 討論

本次研究采集的樣品為非損傷取樣方法采集，使用糞便樣本提取的DNA數(shù)量有限且質(zhì)量較差，線粒體標(biāo)記可能出現(xiàn)擴(kuò)增錯(cuò)誤等問(wèn)題。在采樣過(guò)程中盡可能采集新鮮糞便以保證提取的DNA質(zhì)量，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)雙向測(cè)序和重復(fù)測(cè)序的方法，讓每個(gè)DNA樣品至少通過(guò)兩次獨(dú)立的擴(kuò)增、測(cè)序來(lái)保證其測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

遺傳多樣性是評(píng)估種群在野外長(zhǎng)期生存能力的重要指標(biāo)，也是制定物種保護(hù)計(jì)劃所必需的內(nèi)容之一。衡量一個(gè)種群線粒體DNA多樣性有兩個(gè)指標(biāo)：?jiǎn)伪缎投鄻佣戎?h)和核苷酸多樣度值(π)。h值和π值越大，群體的多態(tài)性程度越高，遺傳多樣性也越豐富。通過(guò)與其他馬鹿亞種線粒體Cytb區(qū)DNA的研究相比較，發(fā)現(xiàn)阿拉善馬鹿的h值和π值都較低(表1)。表明阿拉善馬鹿的遺傳多樣性較低，分析原因可能是賀蘭山周圍被城市、沙漠、河流(黃河)隔斷形成孤島的地理特征所影響，易發(fā)生近親繁殖，缺少有效的基因交流，從而導(dǎo)致阿拉善馬鹿種群的遺傳多樣性降低。

在本研究的10個(gè)突變位點(diǎn)中無(wú)堿基插入和缺失，說(shuō)明該物種的線粒體CytbDNA突變是近期發(fā)生的[26]。且在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中明顯看到阿拉善馬鹿聚為一個(gè)單系，這與同域分布的賀蘭山巖羊在中國(guó)不同地理種群的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)結(jié)果相似[27]。中性檢驗(yàn)除Fu’sFs為顯著負(fù)值外，都為不顯著的負(fù)值，表示群體可能經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張。從系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)與單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中發(fā)現(xiàn)阿拉善馬鹿與東北馬鹿親緣關(guān)系較近，與甘肅馬鹿、四川馬鹿、西藏馬鹿親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表1 多個(gè)馬鹿亞種的遺傳多樣性參數(shù)比較

Tab.1 Comparison of genetic diversity parameter of muti-subspecies of red deer

本研究證明了阿拉善馬鹿遺傳多樣性較低，且與東北馬鹿親緣關(guān)系較近，與中國(guó)分布的其他馬鹿亞種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在本研究的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中(圖2，圖3)看到中國(guó)分布的這6個(gè)馬鹿亞種先分化成兩支，后分化出東北馬鹿、甘肅馬鹿、四川馬鹿、西藏馬鹿和阿拉善馬鹿(圖2)。進(jìn)一步證明了中國(guó)馬鹿是從中東和歐洲返回大陸的過(guò)程中是從西向東逐漸分化的[4]，這為中國(guó)馬鹿的分子系統(tǒng)進(jìn)化和大陸遷移史研究提供了科學(xué)依據(jù)。

致謝：感謝寧夏賀蘭山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和內(nèi)蒙古賀蘭山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的工作人員在樣品采集過(guò)程中給予的幫助。