高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定黃氏響聲含片中貝母素甲和貝母素乙含量

陸 丹，趙懿清 ，高秋芳 ，郭衛(wèi)東，鄒濟(jì)高

（1.江蘇省無(wú)錫市第三人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214000； 2.江蘇省無(wú)錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司，江蘇 無(wú)錫 214000）

黃氏響聲含片為復(fù)方制劑，由薄荷、浙貝母、連翹、蟬蛻、胖大海、酒大黃、川芎、兒茶、桔梗、訶子肉、甘草、薄荷腦等藥材組方，可疏風(fēng)清熱、化痰散結(jié)、利咽開(kāi)音。方中浙貝母為君藥，可解毒散結(jié)消癰[1]，其主要成分為貝母素甲（浙貝母堿）和貝母素乙（去氫浙貝母堿）[2]。本研究中采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）法測(cè)定黃氏響聲含片中貝母素甲和貝母素乙的含量，為該制劑的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括OpenLab工作站（美國(guó)Agilent公司）；ALLTECH 3300型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)奧泰科技<中國(guó)>有限公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W）。

1.2 試藥

黃氏響聲含片（無(wú)錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限 公 司，批號(hào)分別為 171112，171121，171124，171204，171206，171207，180201，180204，180301，180303，180401，180403，180405，規(guī)格為每片 0.6 g）；貝母素甲對(duì)照品（批號(hào)為110750-201612，純度為96.2%）、貝母素乙對(duì)照品（批號(hào)為110751-201712，純度為97.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini-NX C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -水（65 ∶35，V/V，含0.035% 二乙胺）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；ELSD參數(shù)：漂移管溫度為70℃，載氣流速為1.4 L/min。

2.2 溶液制備

取貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品各適量，精密稱定，置容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，制成貝母素甲和貝母素乙質(zhì)量濃度分別為0.515 0 g/L和0.503 1 g/L的對(duì)照品貯備液，取適量，制得貝母素甲和貝母素乙質(zhì)量濃度分別為0.506 4 g/L和0.503 7 g/L的混合對(duì)照品溶液。取樣品適量，搗碎，研細(xì)，過(guò)4號(hào)篩，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入濃氨水-乙醇（1∶2，V/V）10 mL，密塞，浸泡 30 min，加乙醚-三氯甲烷-乙醇（50 ∶16 ∶5，V/V/V）混合溶液 25 mL，超聲處理 30 min（控制水溫低于30℃），濾過(guò)，濾渣用適量乙醚-三氯甲烷 -乙醇（50∶16∶5，V/V/V）洗滌 3次，合并濾液和洗液，60℃水浴揮干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相2 mL溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方和工藝制備缺浙貝母的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果理論板數(shù)按貝母素甲、貝母素乙峰計(jì)均不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好，保留時(shí)間分別為6.273 min和7.957 min，對(duì)稱因子分別為0.82和0.84。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5，4.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，制得系列對(duì)照品溶液，精密量取20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（μg/mL）的自然對(duì)數(shù)值（X）為橫坐標(biāo)、峰面積的自然對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得貝母素甲和貝母素乙回歸方程分別為Y甲=1.4647X甲-0.1089（r=0.9998，n=5），Y乙=1.453 6X乙-0.016 0（r=0.999 9，n=5）。結(jié)果表明，貝母素甲和貝母素乙質(zhì)量濃度線性范圍分別為25.32～202.56 μg/mL和25.19～201.48 μg/mL。

定量限與檢測(cè)限考察：精密量取混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)磾M訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙的定量限分別為189.9ng和251.9ng，檢測(cè)限分別為79.1 ng和75.6 ng。

精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為1.51%和0.85%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品（批號(hào)為180403）溶液適量，分別于室溫下放置 0，1，2，4，8，12 h，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為2.28%和1.77%（n=6），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取樣品（批號(hào)為180403）適量，精密稱定，同法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙平均含量分別為 36.619 μg/g和 15.677 μg/g，RSD分別為2.47%和2.24%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品（批號(hào)為180403）6份，每份約2.5 g，精密稱定，分別加入一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，同法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取13批樣品各適量，同法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，各批次間貝母素甲和貝母素乙的含量存在一定差異，平均含量分別為0.030 7 mg/g和0.0136 mg/g，RSD分別為10.02%和9.01%，平均總含量為0.0444mg/g，RSD為8.57%；以平均含量的80%制訂含量下限，樣品中貝母素甲、貝母素乙及總含量應(yīng)分別不低于 0.024 6 mg/g，0.010 9 mg/g，0.035 5 mg/g，各批樣品均符合要求。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 分析條件選擇及優(yōu)化

貝母類(lèi)生物堿為異甾類(lèi)生物堿，文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法有薄層掃描法、HPLC法、柱前衍生化HPLC法、柱前衍生化氣相色譜法[3]、近紅外光譜法[4]、化學(xué)發(fā)光分析法等[5]。由于貝母素甲無(wú)紫外吸收，貝母素乙僅有末端吸收，不宜用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，同時(shí)考慮到靈敏度及操作的簡(jiǎn)便性，因此采用HPLC-ELSD法分析，效果較佳。

為了降低靈敏度損失，同時(shí)使流動(dòng)相充分揮發(fā)，選擇不分流模式。在此基礎(chǔ)上考察漂移管溫度及載氣流速，最終確定漂移管溫度70℃，載氣流速1.4 L/min。

2015年版《中國(guó)藥典（一部）》浙貝母藥材和復(fù)方黃氏響聲丸項(xiàng)下均采用HPLC-ELSD法測(cè)定貝母素甲和貝母素乙的含量，試驗(yàn)中考察了流動(dòng)相乙腈-水的比例（70 ∶30，65 ∶35）及二乙胺的加入量（0.030%，0.035%，0.050%）對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，流動(dòng)相為乙腈-水（65∶35，V/V，含 0.035%二乙胺）時(shí)，待測(cè)成分分離良好[1]。

3.2 樣品前處理方法優(yōu)化 [1，6-15]

以待測(cè)成分含量為指標(biāo)，優(yōu)化樣品前處理方法?？紤]峰面積的適宜性，供試品的取樣量選擇5 g，保持取樣量不變，考察濃氨水-乙醇（1∶2，V/V）混合液的用量為 2，3，5，10，15，20 mL 時(shí)的浸泡效果。結(jié)果顯示，當(dāng)用量為20 mL時(shí)色譜峰基線不穩(wěn)，10 mL和15 mL的浸泡效果均較佳，考慮到經(jīng)濟(jì)性，混合液用量選擇10 mL。分別用超聲和加熱回流方式提取供試品溶液，結(jié)果兩者提取效果基本一致，超聲提取更簡(jiǎn)便，故選擇超聲提取。比較乙醚 -氯仿 -乙醇（50∶16∶5，V/V/V）、三氯甲烷 -甲醇（4∶1，V/V）和流動(dòng)相為超聲溶劑時(shí)的提取效果，結(jié)果顯示，用流動(dòng)相處理的樣品很黏稠，糖類(lèi)物質(zhì)被提取出而影響測(cè)定，采用乙醚-氯仿-乙醇（50∶16∶5，V/V/V）作為超聲溶劑，提取效果最佳，可滿足測(cè)定要求?？疾斐曁崛∪軇┝糠謩e為15，25，50 mL時(shí)的提取效果，結(jié)果表明，加入混合提取液25 mL即可將貝母素甲、貝母素乙提取完全。設(shè)置超聲時(shí)間為15，30，45 min，考察提取效果，結(jié)果超聲處理30 min即可將貝母素甲、貝母素乙提取完全。比較乙腈、水、甲醇、流動(dòng)相4種復(fù)溶溶劑，結(jié)果顯示，貝母素甲、貝母素乙在水中的溶解性較差，水復(fù)溶樣品未見(jiàn)出峰，用流動(dòng)相溶解樣品處理效果最佳，可滿足測(cè)定要求。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，可用于測(cè)定黃氏響聲含片中貝母素甲和貝母素乙的含量。