反相高效液相色譜法同時(shí)測定呋柳粉中水楊酸、苯甲酸和呋喃西林含量

戴安印，劉潔瓊，谷 娜，郭勝才

（中國人民解放軍第一一七醫(yī)院，浙江 杭州 310013）

呋柳粉為我院研制的非標(biāo)準(zhǔn)制劑，主要成分有水楊酸、苯甲酸、硼酸、呋喃西林和鞣酸等，有殺菌、消炎、收斂和抑制霉菌生長作用，臨床主要用于治療各種足癬、手癬，已在我院臨床使用多年，療效顯著。我院現(xiàn)行的呋柳粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有定性鑒別，缺少對主要成分的含量測定。為了更好地控制該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，保障臨床用藥安全，本研究中參考2015年版《中國藥典（二部）》及文獻(xiàn) [1-7] ，建立了同時(shí)測定呋柳粉中水楊酸、苯甲酸和呋喃西林含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；FA2004B型電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；pHS-3C型精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-100DY型醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

苯甲酸對照品（批號為100419-201302，純度為100.0%），水楊酸對照品（批號為10906-201104，純度為99.9%），呋喃西林對照品（批號為101167-201001，純度為99.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；呋柳粉（我院自制，批號分別為 20170425，20170609，20171029，規(guī)格為每盒30 g，含水楊酸、苯甲酸各9.375g，呋喃西林0.937 5 g）；甲醇（色譜純，江蘇省淮安市恒天工貿(mào)有限公司）；水為純化水；硼酸、鞣酸為藥用標(biāo)準(zhǔn)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鈉（用磷酸調(diào)pH至7.0，30 ∶70，V/V）；檢測波長：275 nm；流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，各待測成分峰形良好分離度均大于1.5，理論板數(shù)以水楊酸、苯甲酸和呋喃西林峰計(jì)均大于3 000。

2.2 溶液制備

稱取按處方比例配制的硼酸、鞣酸陰性藥粉0.0962 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水約80 mL，50℃超聲30 min使溶解，冷卻至室溫，加水定容，搖勻，濾過，即得陰性對照溶液。稱取樣品（批號為20171029）0.095 7 g，精密稱定，同法制得供試品溶液。稱取苯甲酸對照品0.074 4 g，水楊酸對照品0.075 8 g，呋喃西林對照品0.010 1 g，精密稱定，同法制得對照品貯備液，精密量取4 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密量取2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，詳見圖1。可見，陰性對照溶液在水楊酸、苯甲酸、呋喃西林峰保留時(shí)間處無干擾，專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下對照品貯備液2，3，4，5，6 mL，置 10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，作為線性系列供試品溶液，精密量取10 μL，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，分別以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，水楊酸為Y1=2.00X1-9.65，r=0.999 7（n=5），苯甲酸為Y2=4.96X2-17.74，r=0.999 6（n=5），呋喃西林為Y3=27.52X3-31.41，r=0.999 6（n=5）。結(jié)果表明，水楊酸、苯甲酸和呋喃西林質(zhì)量濃度分別在 151.45～454.35 μg/mL、148.81～446.40 μg/mL、20.08 ～60.24 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：在擬訂色譜條件下，精密量取2.3項(xiàng)下3號標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測定峰面積。結(jié)果苯甲酸、水楊酸及呋喃西林峰面積的RSD分別為0.70%，0.69%，0.67% （n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批樣品（批號為20171029）約0.1 g，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果苯甲酸、水楊酸及呋喃西林含量的RSD分別為0.72%，0.65%，0.99%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：稱取樣品（批號為20171029）適量，依法制備供試品溶液，室溫下于 0，4，8，12，24 h 時(shí)分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果苯甲酸、水楊酸及呋喃西林峰面積的RSD分別為1.08%，0.72%，0.82%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的樣品（批號為20171029）9份，各12 mg，精密稱定，分別置9個(gè)25 mL容量瓶（編號1-9）中，加水約15 mL，50℃超聲30 min使溶解，冷卻至室溫，加水定容，搖勻，①②③號容量瓶中各精密加入2.2項(xiàng)下對照品貯備液4 mL，④⑤⑥號瓶中各精密加入5 mL，⑦⑧⑨號容量瓶中各精密加入6 mL，加水定容，搖勻，即得。依法進(jìn)樣測定，分別記錄峰面積，計(jì)算平均回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測定

稱取3批樣品，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定（%，n=3）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

將苯甲酸、水楊酸和呋喃西林對照品的稀溶液用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，苯甲酸在230nm波長處，水楊酸在230nm和300 nm波長處，呋喃西林在260 nm和375 nm波長處有最大吸收，考慮到呋柳粉中呋喃西林的含量最低（約為苯甲酸和水楊酸的1/10），故選擇盡量接近呋喃西林最大吸收波長作為檢測波長。在275 nm處三者吸收度相近，可同時(shí)滿足3種成分的紫外檢測，色譜峰分離度好，峰形良好，且不受其他成分干擾，故最終選擇275 nm為檢測波長。

3.2 流動相選擇

通過查閱文獻(xiàn) [3-6] ，比較了不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸氫二鈉、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-1%冰醋酸溶液等流動相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)被測組分的保留時(shí)間隨著甲醇濃度的增大而減小，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，苯甲酸與水楊酸峰分離度小于1，兩峰有部分重疊。通過對色譜峰的分離度、保留時(shí)間及峰形等綜合考慮，最終選擇甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鈉（30∶70，V/V）作為流動相體系。

此外，哈永紅等[1]的類似研究中采用高效液相色譜雙波長外標(biāo)法測定足菌清中4種成分（水楊酸、苯甲酸、間苯二酚及呋喃西林），以0.05 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇（用0.1%三乙胺調(diào)pH至4.3～4.4，50∶50，V/V）為流動相，以260nm作為呋喃西林和間苯二酚的測定波長，以280nm作為苯甲酸和水楊酸的測定波長，結(jié)果滿意。

相較而言，本研究中利用RP-HPLC單波長法對呋柳粉中多個(gè)成分進(jìn)行含量測定，方法簡單、操作方便，各成分分離度好，峰形良好，且保留時(shí)間縮短一半，能顯著提高工作效率，適用于醫(yī)院制劑呋柳粉的質(zhì)量控制。