靖州茯苓三萜類成分對A549細胞中Nrf2信號通路的調(diào)控機制研究*

金 蘋，吳方評

（湖南醫(yī)藥學(xué)院·侗醫(yī)藥研究湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418000）

湖南省懷化市靖州苗族侗族自治縣是全國茯苓的主要集散地，茯苓也是懷化特色的“藥食同源”中藥。茯苓為中藥配伍常用藥，其三萜類成分對肺癌等惡性腫瘤作用明顯[1-5]。但靖州茯苓三萜類成分對A549細胞中核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號通路的影響鮮有報道。人醌NADH脫氫酶1（NQO1）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）等是Nrf2信號通路的下游基因，兩者的活力和蛋白表達水平可反映Nrf2信號通路激活情況[6-10]。本研究中通過體外試驗研究靖州茯苓三萜類成分對A549細胞增殖及其細胞中Nrf2，NQO1，GST蛋白表達水平的影響，以此探討三萜類成分抑制肺癌細胞擴散的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試藥與儀器

細胞：A549細胞（ATCC），購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

試藥：靖州茯苓（批號為20150701），購自懷化龍源藥業(yè)有限公司，經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院鄧偉峰教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核；RPMI 1640培養(yǎng)基（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；RIPA細胞裂解液（編號P0013C）、麗春紅染料（編號P0022），均購自碧云天生物技術(shù)研究所；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，南京化學(xué)試劑有限公司）；胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司）。

儀器：ClassⅡBiosafety Cabinet生物安全柜（美國Labconco公司）；HERA CELL 500型 CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；酶標儀、電泳儀（美國Bio-Rad公司）；LC-350型超聲波清洗儀（山東濟寧魯超超聲設(shè)備有限公司）；Nikon Eclipse TS100型倒置顯微鏡（日本尼康公司）；ZW-A型微量振蕩器（常州國華電器有限公司）；LDZX-50K型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；5430R冷凍離心機（德國艾本德公司）；AL204型電子分析天平，Nanodrop 1000型微量紫外分光光度計（瑞士Mettler Toledo公司）；HH-60型數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴鍋（常州國華電器有限公司）；JB50-D型增力電動攪拌機（上海標本模型廠）。

1.2 方法

1.2.1 三萜提取物制備

取藥材樣品，去雜質(zhì)，置50℃烘箱中，3 h烘干，取出干燥后的藥材樣品，粉碎，過4號篩，取粉末10 g，用20倍質(zhì)量乙酸乙酯提取3次，每次提取30 min，3層紗布濾過，合并濾液，回收溶劑，烘干，即得靖州茯苓三萜[11]。

1.2.2 噻唑鹽比色（MTT）法檢測細胞存活率

取對數(shù)生長期A549細胞，加胰酶消化2 min，再加入含10%小牛血清的DMEM不完全高糖培養(yǎng)液，終止消化，并吹打細胞，使細胞全部進入培養(yǎng)基，離心，倒掉含有胰酶的上清液，重新加入上述培養(yǎng)基制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度，接種于96孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL。將接種好的96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，去除孔內(nèi)原有的培養(yǎng)基，每孔加入用空白培養(yǎng)基稀釋過的茯苓三萜溶液，使其質(zhì)量濃度分別為500，250，125，62，31，15，7.5，3.75 μg/mL，設(shè)為茯苓三萜 1 ～8 組，另設(shè)陽性對照組（順鉑，質(zhì)量濃度為10 μg/mL）和空白對照組，每個質(zhì)量濃度設(shè)置6個復(fù)孔，然后繼續(xù)放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10%MTT的空白培養(yǎng)基（5 mg/mL MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止，去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，將96孔板置微量振蕩儀上振搖10 min，待結(jié)晶充分溶解后放入酶標儀，測定吸光度值（A），檢測波長為470，590 nm，重復(fù)3次，并按下式計算細胞生長抑制率 [半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為 109.9 μg/mL] 。

1.2.3 Westernblot法檢測 Nrf2，GST，NQO1的蛋白表達

以含10%胎牛血清的1640 DMEM培養(yǎng)液，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細胞，每天換培養(yǎng)基1次，隔天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞并調(diào)整細胞密度，接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入質(zhì)量濃度為30，60，90，120 μg/mL的茯苓三萜溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄原上清液，細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，每孔加入細胞裂解液 200 μL，冰上裂解 30 min，4 ℃下 13 000 r/min 離心5 min，收集細胞裂解液。

細胞裂解液煮沸變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，灌制5%濃縮膠，10%分離膠，上樣20 μL，濃縮膠電壓為85 V，時間為30 min，分離膠電壓為120 V，時間為80 min，待溴酚藍到達距離膠底部約0.5 cm處即停止電泳，膠帶放入轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡15 min（濕法電轉(zhuǎn)）。然后恒流 200 mA，轉(zhuǎn)印 90 min，將蛋白從 SDSPAGE凝膠上轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，采用麗春紅染色，牛血清白蛋白（BSA）封閉后加入抗Nrf2（稀釋比 1 ∶600，貨號 ab31163）、GST（稀釋比 1 ∶700，貨號 ab153949）、NQO1（稀釋比 1 ∶650，貨號 ab34173）、β-actin（稀釋比 1 ∶3 000，貨號 ab16039）4 ℃ 孵育過夜，最后加入二抗（稀釋比1∶3 000，貨號ab6789）孵育2 h，室溫振搖1 h，回收二抗，洗3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，顯影，定影，清洗。將條帶灰度值數(shù)字化。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 A549細胞存活率

作用24h內(nèi)，當茯苓三萜溶液質(zhì)量濃度大于15μg/mL時，A549細胞存活率開始降低，且隨質(zhì)量濃度升高而顯著下降；當茯苓三萜質(zhì)量濃度為250 μg/mL時，A549細胞存活率與陽性對照組基本持平。結(jié)果表明，靖州茯苓三萜質(zhì)量濃度大于250 μg/mL時對A549細胞的增殖具有抑制作用，其IC50=109.9 μg/mL。結(jié)果見表1和圖1。

表1 茯苓三萜類成分對A549細胞存活率的影響

圖1 茯苓三萜類成分對A549細胞存活率的影響

2.2 Nrf2，GST，NQO1 蛋白表達水平

當茯苓三萜溶液質(zhì)量濃度為30 μg/mL時，A549細胞中Nrf2，GST，NQO1的蛋白表達水平與空白對照組相比均顯著升高（P<0.05）。隨質(zhì)量濃度的進一步增加，Nrf2，GST，NQO1的蛋白表達水平也升高，且具有劑量依賴性。結(jié)果表明，茯苓三萜對A549細胞中Nrf2信號通路具有調(diào)控作用。將其結(jié)果進行灰度掃描（n=3）和統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 茯苓三萜類成分對A549細胞中Nrf2，GST，NQO1蛋白表達水平的影響

圖3 Western blot灰度掃描結(jié)果（n=3）

3 討論

茯苓為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，為我國常用中草藥，有利水消腫、健脾、滲濕、寧心等功效，為中藥配伍常用藥，目前已知的以其原料配伍的中成藥超過300種。茯苓的化學(xué)成分主要有多糖、三萜類化合物（茯苓素、茯苓酸）等[12]。仲兆金等[13]從茯苓中分離得到三萜類成分及其衍生物，并發(fā)現(xiàn)其對人慢性髓樣白血病細胞（K562細胞）具有明顯抑制作用，可影響小鼠T淋巴細胞的增殖。茯苓所含三萜類成分有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗炎等作用，并可誘導(dǎo)人白血病細胞系HL-60細胞的分化，且對肺癌、卵巢癌、子宮肌瘤、皮膚癌、直腸癌、中樞神經(jīng)癌等作用明顯[1-5]，是茯苓的重要有效成分。還有研究表明，茯苓素對艾氏腹水瘤、白血病L1210、肉瘤S180細胞有顯著抑制作用，對小鼠Lewis肺癌的轉(zhuǎn)移也有一定抑制作用[1，13]。

肺癌在許多國家和地區(qū)的發(fā)病率不斷升高，已超過肝癌，成為致死率最高的腫瘤。以浙江省樂清市為例，2012年至2015年惡性腫瘤年平均發(fā)病率為248.85/10萬[14]。A549細胞為非小細胞肺癌細胞系。A549細胞模型是目前國內(nèi)外研究肺癌的主要細胞模型。肺癌的發(fā)生和惡化受到多種因素的影響，其中Nrf2信號通路和其下游基因GST和NQO1為關(guān)鍵的影響因素。NQO1將醌類等異源性物質(zhì)還原為氫醌，繼而被結(jié)合排出，避免醌類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為半醌類，從而達到保護細胞的作用。GST催化GSH與親電子物質(zhì)結(jié)合，最終形成硫醚氨酸排出體外，在解毒功能上起著重要作用。Nrf2-ARE信號通路和預(yù)防肺癌發(fā)生及其惡化密切相關(guān)，其本身和其下游基因GST和NQO1蛋白表達水平可反映Nrf2-ARE信號通路被激活的情況。在本試驗中，靖州茯苓三萜類成分可引起A549細胞的氧化應(yīng)激性，啟動自我防護機制，具體表現(xiàn)為提高Nrf2，GST，NQO1蛋白表達水平，繼而增強Ⅱ相解毒酶GST和NQO1的活力，說明靖州茯苓三萜類成分可通過抑制Nrf2-ARE信號通路而延長早期肺癌向晚期肺癌的轉(zhuǎn)移時程。