非強(qiáng)心甾類Na+/K+-ATP酶小分子抑制劑的研究進(jìn)展

梁光平，江仁望

(1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，貴州 遵義 563006；2.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

隨著世界范圍內(nèi)的人口老齡化進(jìn)程的加快，高血壓、冠心病等心血管疾病的發(fā)病率逐年上升，致使心衰的患病率也逐漸升高[1]。目前，我國的心衰患者約400萬[2]。由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常而導(dǎo)致心臟射血能力受損，臨床上主要表現(xiàn)為呼吸困難和乏力，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其五年生存率和惡性腫瘤相似[3-4]。研究表明[4]，心衰主要是由于生物體內(nèi)Na+/K+-ATP酶(簡稱NKA)對細(xì)胞膜電位的調(diào)節(jié)功能失去平衡所致。利用一些特殊的小分子配體對NKA進(jìn)行抑制性調(diào)節(jié)可有效的改善心衰的癥狀，而這些對NKA具有抑制活性的小分子配體也被稱為NKA抑制劑。天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物作為NKA抑制劑的主要來源，經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)已積累了豐富的研究資料，集中歸納可分為以地高辛、洋地黃毒苷為代表的強(qiáng)心甾類成分以及其他的非強(qiáng)心甾類成分。本文根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，重點(diǎn)對非強(qiáng)心甾類NKA小分子抑制劑的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 Istaroxime及其類似物

Istaroxime，即(z,e)-3-[O-(2-氨基乙基)酮肟]-(5α)-雄甾-3,6,17-三酮，最初是由意大利Sigma-Tau公司旗下的Gobbini等學(xué)者發(fā)現(xiàn)的。他們以來源于豆科植物幾內(nèi)亞格木(Erythrophleumsuaveolens(Guill.& Perr.) Brenan)中的二萜生物堿Cassaine(1)作為模型，通過化學(xué)合成獲得具有酮肟結(jié)構(gòu)的化合物(圖1，2)[5-6]。對二者進(jìn)行活性測試發(fā)現(xiàn)，istaroxime對NKA的抑制活性(IC50= 0.2 μM)高于卡灑因(cassaine,IC50= 5.0 μM)，是cassaine對NKA抑制活性的25倍[7]。此外，istaroxime除了可以抑制NKA，還可以通過影響肌質(zhì)網(wǎng)對Ca2+的攝取[8-9]，引起心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，發(fā)揮正性肌力作用。與傳統(tǒng)的甲型強(qiáng)心苷類藥物(如地高辛)相比，istaroxime對NKA的抑制活性更強(qiáng)，不良反應(yīng)也更少[10-12]。目前，istaroxime已作為新型強(qiáng)心藥進(jìn)行開發(fā)，并通過FDA審批完成II期臨床研究[13]，有望成為代替地高辛等強(qiáng)心甾類藥物的新型強(qiáng)心藥。

鑒于istaroxime對NKA具有良好的抑制活性，Gobbini等[14]合成了一系列C3位和C6位具有不同取代基的istaroxime類似物，并通過活性測試以考察C3位、C6位不同取代基對其NKA抑制活性的影響。對于將C3位取代基變換為其他含氮取代基時，所有化合物對NKA都具有抑制活性。但是，只有少數(shù)幾個化合物對NKA的抑制活性強(qiáng)于istaroxime，并且當(dāng)C3位的含氮取代基呈鏈狀時，這些化合物對NKA的抑制活性隨著取代基的增長而顯著減低。當(dāng)C3位取代基為氮雜環(huán)時，化合物對NKA的抑制活性隨著含氮雜環(huán)與甾核的距離或氮雜環(huán)的增大而減弱。同時，大部分化合物對NKA的抑制活性似乎也與胺的種類有關(guān)，C3位被一級胺、二級胺取代的化合物，其活性比三級胺取代的化合物更強(qiáng)(見表1)。

圖1 Cassaine和Istaroxime的結(jié)構(gòu)

表1 C3位不同取代基的istaroxime類似物及其NKA抑制活性

編號構(gòu)型RIC50(μM)編號構(gòu)型RIC50(μM)3z,e0.3710z,e0.244z,e0.3811z,e40.55z,e28.512z,e0.0266z,e0.6913z,e1.307z,e0.2314z,e11.08z,e1.8015z,e23.09z,e0.1016e1.10

對于將C6位的羰基變換為其他常規(guī)取代基時，大部分化合物的活性也同樣減弱[15]。例如，C6位被乙酰胺取代時，化合物對NKA的抑制活性相對于istaroxime降低了近400倍；C6位被羥肟或甲氧肟基取代時，化合物的活性則提升了4倍以上。但是，當(dāng)C6位肟取代基的空間體積越大時，化合物的活性則越弱。說明C6位被沒有構(gòu)型變化以及空間體積小的基團(tuán)(如-C=N-)取代時，有利于提高化合物的活性，而當(dāng)C6位被具有空間構(gòu)型變化的基團(tuán)(如-OH、-COOH、-NHAc等)取代時，由于該位置具有構(gòu)型的不確定性，化合物的NKA抑制活性呈減弱趨勢(見表2)。

表2 C6位不同取代基的istaroxime類似物及其NKA抑制活性

編號RIC50(μM)編號RIC50(μM)17=CH20.04226α-Me0.3018=CF20.1927α-OMe0.7119(e)=NOH0.02428α-COOH16.020(e)=NOMe0.01729α-NHAc45.021(e)=NOEt1.730β-OH2.122(e)=NOAllyl43.031β-CH2OH1.623α-OH0.5232β-CH2OMe3.024α-CH2OH0.1833β-Me6.025α-CH2OMe0.5034β-OMe1.5

此外，Cerri A等[16]學(xué)者還利用C17被羰基以及醛基取代的雄甾酮為原料，對C17位的取代基進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，并評價了這些化合物的NKA抑制活性(見表3)。結(jié)果表明，當(dāng)修飾發(fā)生在C17位醛基時，化合物末端被含氮取代的NKA抑制活性普遍優(yōu)于末端為-H、-Me、-OH、-COOH的化合物。但是，當(dāng)肟醚片段的雙鍵被還原以后，這些末端含氮化合物的NKA抑制活性則呈不同程度的降低。同時，當(dāng)修飾直接發(fā)生在C17位時，即使是末端被含氮取代的化合物，其NKA抑制活性也很弱。根據(jù)研究結(jié)果可知，甾核C17位被6個原子長度的氨基側(cè)鏈取代的化合物具有最強(qiáng)的NKA抑制活性。

表3 C17位不同取代基的肟醚化合物及其NKA抑制活性

編號構(gòu)型RIC50(μM)35eCH=NOH10036zCH=NOH>10037eCH=NOCH33238eCH=NO(CH2)2N(CH3)21.039eCH=NO(CH2)3N(CH3)20.2540eCH=NO(CH2)4N(CH3)22.041eCH=NO(CH2)2NH20.1642eCH=NO(CH2)3NH20.0243eCH=NO(CH2)4NH20.5044e,eCH=CHCH=NOCH34.045e,eCH=CHCH=NO(CH2)2CH31046e,eCH=CHCH=NO(CH2)2OH6.347e,ezCH=CHCH=NOCH2COOH>10048e,eCH=C(CH3)CH=NOCH31049e,eCH=C(CH3)CH=NO(CH2)2OH7.950e,eCH=C(CH3)CH=NO(CH2)2NH20.0351e,eCH=C(CH3)CH=NO(CH2)3NH20.2052e,eCH=C(CH3)CH=NO(CH2)4NH21.2653CH2NHOCH37954CH2NHO(CH2)2N(CH3)25055CH2NHO(CH2)2NH21.5856CH2NHO(CH2)3NH20.4057eCH=CHCH2NHOCH34058eNO(CH2)2N(CH3)2>10059eNO(CH2)3N(CH3)2>10060eNO(CH2)4N(CH3)2>10061eNO(CH2)4NH2>100

2 多羥基呫噸酮

多羥基呫噸酮主要是由Zijian Xie等[18]人為了尋找和開發(fā)非甾體類NKA抑制劑所開展的研究工作。這些多羥基呫噸酮對NKA的抑制活性受呫噸酮骨架中酚羥基數(shù)量和位置的影響(見表4)。當(dāng)酚羥基的連四取代位置處于靠近吡喃環(huán)的氧端，化合物對NKA的抑制活性最強(qiáng)(見表4，67)，其IC50為1.5 μM，與烏本苷(ouabain)相當(dāng)。值得一提的是，呫噸酮類化合物與NKA的相互作用不受Na+、K+或ATP的影響。與ouabain等[17]強(qiáng)心甾不同的是，它在發(fā)揮NKA抑制活性的同時，不激活Src，因而不影響下游信號通路。而當(dāng)呫噸酮骨架上的羥基被甲氧基取代時，這些呫噸酮類化合物對NKA的抑制活性減弱。此外，Zijian Xie等[18]以呫噸酮為藥效團(tuán)還設(shè)計了很多個類似于化合物67的新型NKA小分子配體。

表4呫噸酮類化合物及其NKA抑制活性

編號R1R2R3R4R5R6R7R8IC50 (μM)62OHHOHHHHHH>10063HHOHOHHHHH>10064OHHOHHOHHHH6565HHOHOHOHHHH1066OHHOHHOHOHHH6067HHOHOHOHOHHH1.568HHOMeOMeHOMeHH>10069HHHHHHHH>10070OHHOMeHHHOHOMe>10071OHHOMeHHHOMeOH>10072OMeOMeOMeHHHOMeH>100

3 萜類

萜類化合物在自然界中分布廣泛、種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有多種生物活性。在這些萜類天然產(chǎn)物中，從褐藻Sargassumsiliquastrum(Mertens ex Turner,C.Agardh)分離得到一系列具有苯并吡喃結(jié)構(gòu)的二萜化合物(見表5)，對NKA具有不同程度的抑制活性[19-20]。其中，化合物76、80對NKA的抑制活性與ouabain(IC50= 4.6 μM)的強(qiáng)度接近(見表5)?；衔?8、84對NKA抑制活性的IC50也在10 μM以內(nèi)，這些化合物似乎可以作為NKA抑制劑進(jìn)行開發(fā)。但是，這些化合物與NKA抑制活性的構(gòu)效關(guān)系以及它們與NKA具體的作用方式尚不清楚。

表5具有苯并吡喃結(jié)構(gòu)的二萜化合物及其NKA抑制活性

編號RIC50(μM)編號RIC50(μM)7330.48160.67443.68220.27583.18330.5763.6847.07714.085>100786.08645.07924.487>100804.688>100

除了上述的二萜化合物以外，一些諸如人參皂苷、熊果酸、柴胡皂苷等三萜類天然產(chǎn)物對NKA也具有抑制活性(見圖2)。在這些化合物中，以人參皂苷Rh2(Ginsenoside Rh2，89，IC50= 37.5 μM)和熊果酸(Ursolic acid，90，IC50= 76.7 μM)的活性最強(qiáng)[21]。但是，它們對于NKA抑制活性的強(qiáng)度還是遠(yuǎn)低于ouabain、蟾毒靈等強(qiáng)心甾類成分。

圖2 具有NKA抑制活性的三萜類天然產(chǎn)物

4 黃酮

黃酮是以2-苯基色原酮為基本母核的一類天然產(chǎn)物。根據(jù)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)又分為黃酮、二氫黃酮、黃酮醇、黃烷醇、查爾酮等16種類型。據(jù)文獻(xiàn)報道[22]，具有兒茶素結(jié)構(gòu)的(-)epicatechin(95)、(-)epicatechin-3-gallate(96)、(-)epigallocatechin(97)、(-)epigallocatechin-3-gallate(98)對NKA具有抑制活性。并且當(dāng)C3-OH被沒食子酰基取代以后(96，98)，化合物NKA抑制活性的IC50可達(dá)到1.0 μM。并且(-)epigallocatechin-3-gallate為非特異性的NKA抑制劑，它不僅對NKA具有抑制活性，對H+/K+-ATP酶以及Ca2+-ATP酶亦具有微弱的抑制作用。換言之，(-)epigallocatechin-3-gallate屬于多種P型ATP酶的小分子配體。在黃酮類化合物中，除了上述的幾種兒茶素對NKA具有抑制活性，槲皮素(99，見圖3)對NKA的抑制活性也可達(dá)到微摩爾級(IC50= 73.68 μM)[23]。

圖3 具有NKA抑制活性的黃酮類化合物

5 丹酚酸

丹酚酸是常用中藥丹參水溶性成分的總稱，多具有酚酸性結(jié)構(gòu)，如丹酚酸A(見圖4，100)和丹酚酸B(見圖4，101)。它們對心臟具有多種保護(hù)作用，如心肌缺血再灌注損傷、心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的延遲保護(hù)以及對動脈粥樣硬化的防治等，尤以丹酚酸B的作用最顯著[24]。研究表明，丹酚酸B主要是通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度來實(shí)現(xiàn)對NKA產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而對心臟產(chǎn)生多種藥理活性[25-27]。同時，丹酚酸B與Mg2+形成配合物(見圖4，102)后，可以提高與NKA結(jié)合的穩(wěn)定性。并且通過分子對接模擬發(fā)現(xiàn)，化合物102與NKA相互作用的氫鍵區(qū)域和ouabain類似[28]。此外，利用不同的金屬離子對一些與丹酚酸B具有相似結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行配位后(見圖4，103)，所形成的配合物也具有與丹酚酸B鎂相似的NKA抑制作用[29]。

圖4 具有NKA抑制活性的丹酚酸類化合物

6 生物堿

生物堿是一類含氮的堿性有機(jī)化合物，具有多種生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一。其廣泛分布于植物界，迄今為止在動物中發(fā)現(xiàn)的生物堿極少。在這些生物堿中，血根堿(見圖5，104)對NKA具有較好的抑制活性(IC50= 5.6 μM)，并且血根堿可能作用于強(qiáng)心苷結(jié)合位點(diǎn)[30]。除了血根堿以外，鹽酸小檗堿(見圖5，105)也有較弱的抑制活性。但與血根堿不同的是，鹽酸小檗堿主要是通過關(guān)閉K+通道，刺激Na+/Ca2+離子交換來實(shí)現(xiàn)強(qiáng)心作用[31]。而且，鹽酸小檗堿在100 μM的濃度下，對來源于豬腦的NKA不會產(chǎn)生抑制活性，通過實(shí)驗(yàn)測得其IC50僅為0.69 mM。

圖5 血根堿與鹽酸小檗堿的結(jié)構(gòu)

此外，幾種來源于苦豆子的生物堿(苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿、苦豆堿、野靛堿)對NKA也具有一定的抑制活性(見圖6)。在這6種生物堿中，以苦豆堿、野靛堿對NKA的抑制活性最強(qiáng)(抑制率分別為37.2 %、35.6 %)，并且它們對NKA的抑制活性存在劑量依賴性，其抑制率隨著濃度的增大而升高?；倍▔A、氧化苦參堿對NKA的抑制率分別為25.9 %和18.3 %，處于6個生物堿的中間水平。而苦參堿和槐果堿對NKA的抑制率均低于15.0 %，且沒有劑量依賴性[32]。

圖6 幾種苦豆子生物堿的結(jié)構(gòu)

7 其它化合物

由于NKA普遍存在于各個器官組織中，對NKA具有抑制活性的化合物很多。具有Coumestan骨架的蟛蜞菊內(nèi)酯(112，IC50= 0.7 μM)及其類似物也具有較強(qiáng)的NKA抑制活性(見圖7，113～122)?；衔?13對NKA的抑制活性與蟛蜞菊內(nèi)酯相當(dāng)(IC50= 0.7 μM)。而化合物114～122對NKA抑制活性的IC50為3 ～ 30 μM不等[33-35]。

圖7 具有Coumestan骨架的化合物結(jié)構(gòu)

除了具有Coumestan骨架的化合物，還有如圖8所示的蒼術(shù)酮(123)、紫蘇醇(124)、Ustalic acid(125)對NKA都有不同程度的抑制活性。蒼術(shù)酮對ATP酶的抑制活性為非競爭性的，它可以對NKA、Mg2+-ATP、H+/K+-ATP、H+-ATP、Ca2+-ATP等多種酶都具有抑制活性。但對NKA的抑制活性最強(qiáng)，其IC50為8.9 μM，而且在升高K+濃度時不影響Na+的濃度[36]。紫蘇醇和Ustalic acid對NKA的抑制活性均弱于蒼術(shù)酮，其活性均為毫摩爾級。其中，紫蘇醇對來源于豬腦、豬腎NKA抑制活性的IC50分別為1.0 mM、1.5 mM[37]。Ustalic acid對來源于老鼠腸粘膜細(xì)胞NKA抑制活性的IC50為0.77 mM[38]。

圖8 具有NKA抑制活性的其它化合物

8 展望

地高辛、洋地黃毒苷等強(qiáng)心甾類藥物雖然是臨床上用于治療心衰的主要藥物，但是這些強(qiáng)心甾治療劑量相當(dāng)于中毒量的60%，其安全窗口較小。同時，大量的臨床研究也表明了這些藥物容易引起致命性心律失常，例如異位節(jié)律點(diǎn)自律性增高、房室傳導(dǎo)阻滯、竇房結(jié)抑制等不良反應(yīng)，嚴(yán)重時還會造成患者死亡。對于大多數(shù)患者而言，這些強(qiáng)心甾類藥物并不是理想的強(qiáng)心藥物。因此，積極尋找和開發(fā)非強(qiáng)心甾類強(qiáng)心藥具有重要的臨床意義。

天然產(chǎn)物因具有來源豐富、成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變、毒副作用小、價格低廉特點(diǎn)而成為了藥學(xué)工作者尋找新型強(qiáng)心藥的熱點(diǎn)對象。雖然從中也發(fā)現(xiàn)了一些非強(qiáng)心甾類化合物對NKA具有抑制活性，但這些化合物的NKA抑制活性都比較弱，為了獲得具有更好活性的NKA小分子抑制劑，則需要結(jié)合有機(jī)合成技術(shù)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。其中，關(guān)于istaroxime的研究就是最具代表性的例子。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有理由相信將會有越來越多的高效低毒的非強(qiáng)心甾類小分子用于抑制NKA的活性，進(jìn)而用于治療心力衰竭。