尖銳濕疣皮損中Foxp3、IL-10的表達及意義

黃銀浩，陳永艷，王寶仁

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563099； 2.畢節(jié)市第一人民醫(yī)院 皮膚科，貴州 畢節(jié) 551700)

尖銳濕疣(Condyloma acuminata，CA)是由人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV) 感染引起的臨床常見性傳播疾病，多見于肛周及泌尿生殖器等部位，目前認為CA的發(fā)生及轉歸與機體的免疫功能特別是由T細胞介導的細胞免疫抑制密切有關，但確切機制尚不完全清楚[1]。有研究發(fā)現Tregs細胞在CA細胞免疫抑制中起重要作用[2-4]。本課題采用免疫組織化學方法檢測Foxp3和IL-10在CA皮損中的表達，探討Tregs細胞在CA局部細胞免疫抑制中可能的作用，為減少CA的發(fā)病及復發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2016年7月至2017年7月在我院皮膚性病門診初診且未治療的30例尖銳濕疣患者，均符合CA診斷標準[5]，其中男17例，女13例；年齡20～56歲，平均(31.4±11.1)歲；病程0.5～3個月，平均28d，所有患者6個月內未使用過免疫調節(jié)劑并排除感染性疾病、自身免疫性疾病、嚴重系統(tǒng)性疾病和妊娠。15例為在我院泌尿外科行包皮切除術的健康男性的正常包皮組織(正常對照組)，年齡19～40歲，平均(25.4±9.2)歲。

1.2 主要試劑 濃縮型兔抗人Foxp3多克隆抗體和IL-10多克隆抗體分別購于武漢博士德生物技術有限公司和北京博奧森生物技術有限公司；Maxvision法免疫組化試劑盒為Dako公司產品。

1.3 方法

1.3.1 標本制備 所有標本首先用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，除1張做HE染色外，其余均做免疫組化染色。

1.3.2 HE染色 置于60 ℃烤箱內烘烤切片，分別采用二甲苯、梯度酒精脫蠟至水后染色進行封片，最終完成鏡檢。

1.3.3 免疫組化染色 常規(guī)脫蠟、水化，Foxp3采用 pH=9.0的EDTA微波加熱15 min進行抗原修復，IL-10則采用pH=6.0的0.01%檸檬酸鹽高壓鍋煮沸后保壓3 min抗原修復，室溫下自然冷卻后采用Maxvision二步法：一抗 4 ℃孵育過夜，滴加二抗37 ℃孵育30 min，切片經 DAB 顯色，蘇木精復染，封片。Foxp3和IL-10一抗工作濃度為1∶100。扁桃體組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

1.3.4 結果判斷 Foxp3 、IL-10均以細胞核和(或)細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。每張切片隨機選5個400倍視野的陽性表達區(qū)域采用Olympus相機在固定條件下采圖。采用圖像分析軟件測量每張圖片平均積分光密度(IOD)和總測量面積(Area)，然后用OD值=IOD/Area進行半定量分析。

2 結果

2.1 正常包皮及尖銳濕疣皮損HE染色結果(見圖1)。

A：正常對照組；B：尖銳濕疣組； IHC×100。圖1 IHC下兩組HE染色結果

2.2 Foxp3在尖銳濕疣皮損和正常對照組中的表達 Foxp3陽性細胞主要位于真皮層，正常對照組觀察到少量Foxp3+淋巴細胞(見圖2A)，尖銳濕疣組均能見到大量Foxp3+淋巴細胞(見圖2B)。尖銳濕疣組較正常對照組對比發(fā)現Foxp3+淋巴細胞在尖銳濕疣組的表達明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001，見表1，圖2)。

組別 例數Foxp3tP正常對照15 0.016±0.02038.020<0.001尖銳濕疣30 0.201±0.084?

*：與對照組比較，P<0.001。

A：正常對照組；B：尖銳濕疣組； IHC×400。圖2 IHC下觀察兩組Foxp3陽性細胞

2.3 IL-10 在尖銳濕疣皮損和正常對照組中的表達 IL-10陽性細胞主要位于真皮層，正常對照組觀察到少量IL-10陽性細胞(見圖3A)，尖銳濕疣組均能見到大量IL-10陽性細胞(見圖3B)。IL-10陽性細胞的表達在尖銳濕疣組中明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001，見表2，圖3)。

組別 例數IL-10tP正常對照15 0.021±0.00564.916<0.001尖銳濕疣30 0.206±0.091▲

▲：與對照組比較，P<0.001。

A：正常對照組；B：尖銳濕疣組； IHC×400。圖3 IHC下觀察兩組IL-10陽性細胞

2.4 Foxp3與IL-10表達的相關性 尖銳濕疣皮損中Foxp3與IL-10的表達存在正相關(r=0.873，P<0.01)，見圖4。

圖4 尖銳濕疣皮損中Foxp3和IL-10相關性分析

3 討論

機體局部或全身細胞免疫功能低下是造成病毒持續(xù)感染、復發(fā)以及惡變的主要原因，CA局部細胞免疫功能在其發(fā)病及復發(fā)中起重要作用[6]，感染HPV后可通過多種機制使機體細胞免疫受到抑制而逃脫免疫監(jiān)視，但導致CA細胞免疫抑制的機制目前尚不完全清楚。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Tregs)是具有負性調節(jié)作用的CD4+T細胞亞群[7]，通過分泌IL-10和TGF-β等抑制性細胞因子抑制T、B細胞的活化及IL-2的產生，在維持機體免疫自穩(wěn)、調控免疫應答方面具有重要作用。在病毒感染性疾病中，Tregs細胞具有平衡作用，不僅可以抑制過度免疫反應造成的組織損傷，還抑制某些病原體感染宿主而發(fā)揮有效的保護性免疫反應，不利于宿主對病原體的清除，因此Tregs細胞數量和功能異常與病毒感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[8]。叉頭狀/翅膀狀螺旋轉錄因子(Forkhead/winged helix transcription factor，Foxp3)是Tregs細胞最特異的分子標記，也是其生長發(fā)育和發(fā)揮免疫抑制功能的關鍵[9]。成熟小鼠或人類Tregs細胞缺失Foxp3將失去其抑制能力，同時增強組織炎癥反應，提示Foxp3持續(xù)表達對Tregs細胞的穩(wěn)定是必需的[10]，同時Foxp3能促進潛在HPV的復活[11]。對Tregs在CA 患者外周血中的研究表明，CA患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs數量增加，Foxp3mRNA表達水平升高[2,12]，提示CA患者存在全身細胞免疫抑制并與外周血Tregs數量增加相關。有資料表明，CA患者皮損中Foxp3的陽性表達率明顯高于正常包皮組織[13-14]，提示Tregs在CA局部細胞免疫抑制中可能也起重要作用[15]。IL-10是由Tregs細胞分泌的一種具有廣泛免疫效應的細胞因子[4]，有抑制細胞免疫和抵抗炎癥反應兩大作用，可抑制單核細胞、巨噬細胞及T細胞等釋放促炎因子，對樹突狀細胞、B細胞、T細胞和NK細胞等的生成與分化具有調節(jié)作用，誘導它們分化為Tregs細胞[16]。有研究發(fā)現CA患者皮損組織中IL-10mRNA的表達水平高于正常人對照組[17]。為進一步闡明CA局部細胞免疫抑制的可能發(fā)生機制，我們采用免疫組織化學Maxvision方法檢測CA患者皮損中Tregs細胞特異性轉錄因子Foxp3和抑制性細胞因子IL-10的表達，結果顯示CA皮損中Foxp3和IL-10的表達水平均明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，且Foxp3與IL-10的表達存在正相關(P<0.001)。我們推測，HPV感染人體后可在感染局部組織誘導Tregs細胞的活化及增殖，使皮損局部Tregs增多，導致IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子分泌增加，激活免疫反應的負向調節(jié)，抑制了機體局部針對HPV的特異性細胞免疫反應，導致CA皮損局部存在明顯細胞免疫抑制，從而使HPV能夠逃避機體的免疫監(jiān)視而長期存在及復發(fā)。