氯苯甲嗪減輕順鉑導(dǎo)致小鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷

宋思遠(yuǎn)，徐先林，丁憲波，陸紅玲，卓 銘

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.美國(guó)德克薩斯大學(xué) MD安德森腫瘤中心和醫(yī)學(xué)部，Taxax Galveston 77555)

鉑類(lèi)抗癌藥物是用于腫瘤治療的一線抗癌藥物，其中順鉑(Cisplatin，DDP)是順式-二氯二氨合鉑(II)的商品名，是最早應(yīng)用的腫瘤治療藥物，至今仍被廣泛應(yīng)用于多種癌癥的治療，然而順鉑在使用過(guò)程中會(huì)伴有較為嚴(yán)重的神經(jīng)性損傷副作用，如何減輕此類(lèi)副作用一直是國(guó)際臨床抗癌藥物應(yīng)用的難題。背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)來(lái)源于神經(jīng)嵴的脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)的感覺(jué)神經(jīng)母細(xì)胞發(fā)出的軸突，呈束狀，左右對(duì)稱(chēng)的從神經(jīng)管的背部進(jìn)入，是各椎間孔內(nèi)側(cè)面附近脊髓背根的膨脹結(jié)節(jié)。研究表明，順鉑可以在背根神經(jīng)節(jié)中大量積累，導(dǎo)致DRG神經(jīng)元的細(xì)胞體萎縮，神經(jīng)末梢損傷，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡[1-3]。

氯苯甲嗪(Meclizine)是一種組胺受體拮抗劑，商品名為美克洛嗪，多用于治療暈動(dòng)癥引起的眩暈、嘔吐等癥狀，是廣泛應(yīng)用的抗暈車(chē)藥。研究發(fā)現(xiàn)，在小腦動(dòng)脈阻塞的小鼠中風(fēng)模型上，預(yù)注射氯苯甲嗪的小鼠，腦壞死區(qū)域明顯減少[4]；在以增長(zhǎng)多聚谷氨酸片段變異而建立的亨廷頓舞蹈癥模型上，氯苯甲嗪可增加細(xì)胞內(nèi)ATP含量，改善神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)，提高神經(jīng)細(xì)胞的生存率[5]，提示其有神經(jīng)保護(hù)作用。目前，氯苯甲嗪的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制并未完全闡釋清楚，其能否減輕由順鉑造成的DRG神經(jīng)元損傷尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，為了進(jìn)一步了解氯苯甲嗪對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)是否具有保護(hù)作用，本課題選擇小鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元為研究對(duì)象，觀察順鉑與氯苯甲嗪對(duì)DRG神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響，為臨床解決順鉑抗癌的神經(jīng)損傷副作用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年昆明小鼠，雌雄不限，體重25～30 g，購(gòu)買(mǎi)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2018-0003。

1.2 主要儀器設(shè)備 Xcellence型活細(xì)胞工作站，MCO-20AIC型細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.3 主要試劑 順鉑、純度96%氯苯甲嗪、層粘連蛋白、多聚鳥(niǎo)氨酸、Polκ抗體(SIGMA 公司)；神經(jīng)絲蛋白抗體NF200(博士德生物公司)；γH2AX抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、DAPI(invitrogen公司)；TUNEL凋亡試劑盒(Roche公司)；其余試劑為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)及表型鑒定 預(yù)先制作細(xì)胞貼壁包被液放置在24孔板中，于37 ℃，5%CO2環(huán)境中靜置2h以上。為保證DRG神經(jīng)元數(shù)量>105，選擇2只昆明小鼠進(jìn)行樣本組織的提取。使用乙醚麻醉成年昆明小鼠，截取小鼠脊柱，取出背根神經(jīng)節(jié)，放置在組織消化液中，于37 ℃，5%CO2環(huán)境中消化1.5 h，消化結(jié)束后使用ddH2O清洗細(xì)胞貼壁包被液；取出含有DRG神經(jīng)元組織消化液，離心后棄上清，加入DNase I，使用DRG Buffer液稀釋?zhuān)尤隓PBS吹打混勻后過(guò)濾，離心棄上清，向沉淀中加入培養(yǎng)基(DMEM-F12+10%胎牛血清+1%P/S雙抗)，加入NGF，吹打均勻，放入37 ℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，24 h后取出觀察。

取出培養(yǎng)24 h的細(xì)胞爬片，羊血清封閉30 min，棄封閉液，加神經(jīng)絲蛋白NF200一抗(1∶200)，室溫靜置3 h，PBST清洗，加入羊抗鼠二抗，暗室靜置30 min，PBST清洗3次。取干凈載玻片滴加10 μL DAPI，將細(xì)胞爬片細(xì)胞生長(zhǎng)面貼附在DAPI上，暗室靜置2 h，使用活細(xì)胞工作站進(jìn)行觀察，將不同顏色標(biāo)記的特異性蛋白熒光信號(hào)示意圖合并顯示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選取大于20個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。

1.4.2 DDP損傷濃度確定 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程同上。依據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)DDP濃度梯度為20 μmol/L組和30 μmol/L組[6]，接種細(xì)胞后分別加入20 μmol/L DDP和30 μmol/L DDP，培養(yǎng)24 h后，取出在顯微鏡下觀察。

1.4.3 Meclizine安全濃度確定 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程同上。設(shè)Meclizine濃度梯度為5、10、20、50 μmol/L組，接種細(xì)胞后分別加入不同濃度的Meclizine，培養(yǎng)24 h，取出使用神經(jīng)絲蛋白NF200進(jìn)行免疫熒光染色并使用活細(xì)胞工作站觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選取大于20個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。使用ImageJ軟件測(cè)量神經(jīng)絲長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪制柱狀圖。

1.4.4 Meclizine保護(hù)效果的觀察 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程同上。將培養(yǎng)細(xì)胞分為對(duì)照組、順鉑損傷組和氯苯甲嗪預(yù)處理組，向氯苯甲嗪預(yù)處理組中加入5 μmol/L Meclizine，培養(yǎng)4 h，再分別向順鉑損傷組和氯苯甲嗪預(yù)處理組中加入20 μmol/L DDP，培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞加入NF200一抗(1∶200)、γH2AX一抗(1∶1 000)和Polκ(1∶10 000)進(jìn)行免疫熒光染色，使用活細(xì)胞工作站進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選取大于20個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。使用ImageJ軟件測(cè)量特異熒光位點(diǎn)熒光強(qiáng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪制柱狀圖。

1.4.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用TUNEL法凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DRG神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，TUNEL染色后使用神經(jīng)絲蛋白NF200抗體進(jìn)行免疫熒光染色對(duì)細(xì)胞定位，活細(xì)胞工作站觀察，計(jì)數(shù)3個(gè)處理組中被NF200定位的DRG神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)以及凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡百分比，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，收集5次結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 DRG神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)觀察及表型鑒定 顯微鏡下觀察顯示，正常生長(zhǎng)的DRG神經(jīng)元細(xì)胞胞體邊緣折光性明顯，中央部分有明顯陰影，樹(shù)突與軸突從胞體延伸出來(lái)，密集交錯(cuò)，細(xì)胞生長(zhǎng)呈團(tuán)狀聚集(見(jiàn)圖1)。使用NF200染色后，在熒光顯微鏡下可清晰的看到樹(shù)突與軸突中細(xì)長(zhǎng)的神經(jīng)絲蛋白被染色成為綠色，DRG神經(jīng)元胞體也有卷曲的神經(jīng)絲蛋白纏繞在其上(見(jiàn)圖2)。

2.2 DDP作用濃度確定 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DDP濃度為20 μmol/L時(shí)，DRG神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組略有減少，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變；當(dāng)DDP濃度升高為30 μmol/L時(shí)，DRG神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞體積變小，形態(tài)有較大變化，培養(yǎng)液中有較多懸浮細(xì)胞，表明細(xì)胞可能受到較大損傷，出現(xiàn)了細(xì)胞死亡(見(jiàn)圖3)，為更好觀察氯苯甲嗪對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)效應(yīng)，本課題采用了能導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷但又不至于讓細(xì)胞壞死的20 μmol/L DDP劑量。

圖1 DRG神經(jīng)元正常生長(zhǎng)狀態(tài)

圖2 DRG神經(jīng)元神經(jīng)絲蛋白NF200染色

A：Control組；B：20μmol/L DDP組；C：30μmol/L DDP組。圖3 不同濃度DDP對(duì)DRG神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.3 Meczline使用濃度確定 免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組DRG神經(jīng)元染色結(jié)果相比，5 μmol/L Meclizine組中神經(jīng)絲長(zhǎng)度較長(zhǎng)，樹(shù)突與軸突完整性較好，但隨著Meclizine濃度增加，DRG神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也隨之發(fā)生變化，樹(shù)突與軸突完整性逐漸受到破壞，神經(jīng)絲長(zhǎng)度逐漸縮短，表現(xiàn)出抑制DRG神經(jīng)元生長(zhǎng)效果(見(jiàn)圖4～5)。故選擇5 μmol/L為氯苯甲嗪作用濃度。

A：Control；B：5 μmol/L Meclizine；C：10 μmol/L Meclizine；D：20 μmol/L Meclizine；E：50 μmol/L Meclizine;*：與Control組相比較，P<0.05。圖4 不同濃度Meclizine對(duì)DRG神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.4 Meclizine對(duì)DRG神經(jīng)元的保護(hù)效果 使用NF200與γH2AX免疫熒光聯(lián)合染色結(jié)果顯示，與Control組相比較，順鉑損傷組樹(shù)突與軸突長(zhǎng)度縮短，數(shù)量減少(見(jiàn)圖5B)，在DRG神經(jīng)元細(xì)胞胞體中有明顯的DNA損傷特異熒光位點(diǎn)(見(jiàn)圖6)；氯苯甲嗪預(yù)處理后，神經(jīng)絲長(zhǎng)度未見(jiàn)縮短，數(shù)量較多(見(jiàn)圖5C)，DRG神經(jīng)元細(xì)胞胞體中DNA損傷特異位點(diǎn)熒光強(qiáng)度減弱甚至消失(見(jiàn)圖6)。使用γH2AX和Polκ免疫熒光聯(lián)合染色結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，順鉑損傷組中有明顯的特異性DNA損傷修復(fù)熒光位點(diǎn)，熒光強(qiáng)度增加，而氯苯甲嗪預(yù)處理組中，特異性修復(fù)熒光位點(diǎn)熒光強(qiáng)度減弱(見(jiàn)圖7)。

A：Control；B：20 μmol/L DDP；*：與Control組相比，P<0.05。圖5 DDP與Meclizine對(duì)DRG神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)絲長(zhǎng)度影響

箭頭示DNA損傷特異性染色位點(diǎn)。圖6 DDP與Meclizine對(duì)DRG神經(jīng)元損傷的影響

箭頭示DRG神經(jīng)元DNA特異性損傷修復(fù)位點(diǎn)；*：與Control組比較，P<0.05；#：與DDP組比較，P<0.05。圖7 DDP與 Meclizine對(duì)DRG神經(jīng)元DNA損傷修復(fù)的影響

2.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 免疫熒光結(jié)果顯示，相較于Control組，DDP組DRG神經(jīng)元細(xì)胞核有明顯的凋亡小體染色(見(jiàn)圖8)，而氯苯甲嗪預(yù)處理組無(wú)明顯凋亡小體出現(xiàn)。凋亡細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果(見(jiàn)表1及圖9)。

箭頭示細(xì)胞內(nèi)被染色的凋亡小體。圖8 TUNEL法檢測(cè)DRG神經(jīng)元凋亡結(jié)果

表1 TUNEL法檢測(cè)DRG神經(jīng)元細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)

細(xì)胞數(shù)量ControlDDPDDP+Meczline凋亡數(shù)8.4±2.1 13.0±3.4? 4.6±2.1#細(xì)胞總數(shù)91.0±28.926.6±5.745.8±13.8

*：與Control組相比，P<0.05；#：與DDP組相比，P<0.05。

*：與Control組相比，P<0.05;#：與DDP組相比，P<0.05。圖9 DRG神經(jīng)元細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)

3 討論

DDP具有廣泛的抗瘤譜，是臨床腫瘤化療方案中的一線藥物，但在使用DDP的過(guò)程中常常引發(fā)患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)等副作用，甚至引發(fā)萊爾米征，出現(xiàn)頸部沿脊柱向雙下肢傳播的電擊樣麻木伴刺痛的神經(jīng)損傷表現(xiàn)[7]。研究表明，順鉑不能有效穿過(guò)血腦屏障，因此對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷并不明顯。但順鉑可進(jìn)入無(wú)類(lèi)似血腦屏障保護(hù)的外周神經(jīng)系統(tǒng)，富集于DRG神經(jīng)元細(xì)胞。隨著用藥時(shí)間增加，順鉑會(huì)導(dǎo)致DRG神經(jīng)元細(xì)胞體萎縮，神經(jīng)末梢損傷，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡。

目前研究認(rèn)為，順鉑導(dǎo)致DRG神經(jīng)元損傷的機(jī)制主要與DNA損傷有關(guān)，當(dāng)順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，能引發(fā)DNA鏈發(fā)生鳥(niǎo)嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤二聚化，造成DRG神經(jīng)元的核DNA損傷，在抑制DNA復(fù)制的同時(shí)，也抑制基因轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行[8]。γH2AX是與細(xì)胞DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的較為靈敏的指標(biāo)，其在顯微鏡下熒光信號(hào)強(qiáng)度增加表明DNA出現(xiàn)損傷。Polκ是DNA損傷后參與跨損傷修復(fù)的一種DNA聚合酶，其在顯微鏡下的熒光信號(hào)強(qiáng)度增加表明DNA損傷后出現(xiàn)修復(fù)行為，是反映DNA損傷修復(fù)較為靈敏的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)順鉑作用于DRG神經(jīng)元細(xì)胞后，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)受到了抑制，隨著順鉑作用濃度的增大，DRG神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，樹(shù)突與軸突長(zhǎng)度縮短；γH2AX蛋白有較為明顯的特征性熒光信號(hào)，表明DRG神經(jīng)元細(xì)胞在順鉑的作用下，核DNA發(fā)生斷裂，出現(xiàn)明顯的損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]；同時(shí)反映DNA損傷修復(fù)的Polκ蛋白也出現(xiàn)明顯的特征性熒光信號(hào)，表明此時(shí)DRG神經(jīng)元細(xì)胞DNA出現(xiàn)損傷后伴發(fā)修復(fù)行為。而Meclizine預(yù)處理組結(jié)果顯示，預(yù)先使用Meclizine處理DRG神經(jīng)元細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量并未見(jiàn)明顯減少，且樹(shù)突與軸突長(zhǎng)度也未明顯縮短，表明氯苯甲嗪的預(yù)處理可以增強(qiáng)DRG神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，抵抗由順鉑造成DRG神經(jīng)元細(xì)胞損傷。且DRG神經(jīng)元細(xì)胞中反映DNA損傷與修復(fù)的特征性熒光信號(hào)減弱甚至消失，結(jié)果提示Meclizine對(duì)順鉑造成的DRG細(xì)胞核DNA損傷可能具有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)用TUNEL法檢測(cè)DRG神經(jīng)元細(xì)胞凋亡時(shí)觀察到，DDP損傷組細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯的凋亡小體，而氯苯甲嗪預(yù)處理的細(xì)胞中未見(jiàn)凋亡小體，表明氯苯甲嗪可能具有對(duì)抗順鉑所致的DRG神經(jīng)元細(xì)胞凋亡作用。研究表明，死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑均與細(xì)胞凋亡發(fā)生有關(guān)，其中線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡多因藥物及應(yīng)激觸發(fā)有關(guān)。相關(guān)研究已證實(shí)順鉑可以損傷線粒體DNA，造成線粒體功能失常，DNA復(fù)制減緩甚至停止，從而導(dǎo)致線粒體退行性病變[9]，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道，氯苯甲嗪可以增加細(xì)胞內(nèi)ATP含量，改善神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)，提高神經(jīng)細(xì)胞的生存率[5]。本實(shí)驗(yàn)中氯苯甲嗪對(duì)順鉑所致小鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞損傷表現(xiàn)出有一定的保護(hù)作用，推測(cè)其是否通過(guò)改善線粒體氧化磷酸化功能，從而降低了順鉑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。