清胰Ⅱ號湯劑HPLC指紋圖譜研究

鄭小翠，王 森，歐水平，陳 靈，蔡迎迎，任 麗

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099)

急性胰腺炎(acute pancreatities,AP)是臨床上常見的急腹癥，具有較高的發(fā)病率和病死率，20% ～30%發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatities,SAP)[1]。SAP病情兇險，常伴有全身炎癥反應(yīng)綜合征及全身多器官功能不全。清胰Ⅱ號湯由大黃、赤芍、梔子、延胡索、丹皮、木香、厚樸及芒硝等 8 味藥組成，具有疏肝利膽、清熱瀉火、止痛通便的功效，臨床常用于治療AP和SAP，療效顯著[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，清胰復(fù)方的作用機制是多方面的，能抑制胰酶釋放及其活性，增加腸蠕動；短期內(nèi)促進(jìn)腸排空，減輕胃腸壓力及腹壓；改善胃腸道功能和毛細(xì)血管通透性；還可以阻斷炎癥因子釋放，減少炎癥因子對患者胰腺等器官的損害；防止細(xì)菌移位；清除氧自由基，防止過氧化損傷等[4-6]。

目前，對于清胰Ⅱ號湯劑的質(zhì)量控制研究多體現(xiàn)在單一有效成分或幾個主要有效成分如梔子苷、芍藥苷、丹皮酚、大黃素等的HPLC含量測定[7-8]，而對1種或幾種指標(biāo)成分的控制對于中藥本身多組分、多靶點作用特點而言，不能全面反映中藥復(fù)方制劑有效成分總體特征及其內(nèi)在的質(zhì)量特征，從而不能對其整體質(zhì)量進(jìn)行控制。采用指紋圖譜方法可以彌補這些缺點，現(xiàn)在指紋圖譜技術(shù)和研究方法已經(jīng)相對成熟完善，利用指紋圖譜技術(shù)來控制中藥的質(zhì)量已經(jīng)得到了國際的認(rèn)可[9-11]。因此，為了更有效地、系統(tǒng)地控制清胰Ⅱ號湯劑的質(zhì)量，本研究采用HPLC建立清胰Ⅱ號湯劑的指紋圖譜，對其中的特征性成分進(jìn)行指認(rèn)，并將清胰Ⅱ號湯劑的指紋圖譜與組方單味藥材的指紋譜圖進(jìn)行比對，以獲得專屬、整體的綜合特征信息。

1 材料與方法

1.1 儀器 1260型液相色譜儀，包括DAD檢測器(美國Agilent公司)；BT125D電子天平(德國Sartorius公司)；JA1002電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；Exceed-Cd-20 型實驗室超純水機(成都艾科水處理設(shè)備有限公司)；DL-820D超聲儀(上海之信儀器有限公司)；TD5A-WS離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)。2012版 “中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件。

1.2 試藥 大黃素、大黃酸、丹皮酚(購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110756-201512、110757-201607、110708-201407 )，蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、梔子苷、芍藥苷、延胡索乙素、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯(購自成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-17030605、MUST-17030603、MUST-17030622、MUST-17020401、MUST-16041901、MUST-17022720、MUST-17031102、MUST-17020205、MUST-16050705、MUST-16041601)，9批清胰Ⅱ號湯劑(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科代煎，依次標(biāo)記S1～S9)。

大黃(產(chǎn)地四川，批號160301-170401)、赤芍(產(chǎn)地四川，批號160601-170401)、炒梔子(產(chǎn)地四川，批號160301-170401)、丹皮(產(chǎn)地四川，批號160601-170601)、姜厚樸(產(chǎn)地四川，批號(160701-170601)、醋延胡索(產(chǎn)地浙江，批號160801-170701)、木香(產(chǎn)地云南，批號160301-161101)、芒硝(產(chǎn)地青海，批號20160302-20161109)均購自重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)楊建文主任藥師鑒定以上中藥飲片均合格。甲醇、乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 Ultimate LP-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序：0～10 min，2%～10% A；10～100 min，10%～30% A；100～130 min，30%～55% A；130～150 min，55%～85% A；柱溫：30℃；流速：1 mL/min，檢測波長：237 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品4.94、4.90、4.83、4.71、5.29 mg，加少量氯仿使之溶解，加甲醇定容至5 mL，精密稱取梔子苷、芍藥苷、丹皮酚、和厚樸酚、厚樸酚、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、延胡索乙素對照品5.03、4.95、5.06 、5.11、5.14、5.15、5.16、5.21 mg，加甲醇溶解分別定容至5 mL，得單個對照品儲備液。

分別精密量取上述單個對照品溶液150、150、35、120、100、40、50、230、230、470、90、90、90 μL，加甲醇稀釋至5 mL，得梔子苷、芍藥苷、丹皮酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、延胡索乙素的含量分別為94.63、45.56、46.57、6.92、23.53、19.30、7.54、10.58、30.93、30.99、18.41、18.52、18.74 μg/mL的混合對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取9劑清胰Ⅱ號處方，加適量水煎煮3次，合并煎液，濃縮成2 000 mL，得9批清胰Ⅱ號湯劑[12]。精密量取清胰Ⅱ號湯劑5 mL于50 mL離心管中，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補足減少的重量，3 500 rpm 離心10 min，取全部上清于蒸發(fā)皿中揮干，殘渣加甲醇溶解并定容至5 mL ，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，即得。

1.3.4 單味藥材供試品溶液的制備 按清胰Ⅱ號湯劑制備方法分別制得大黃、赤芍、木香、丹皮、厚樸、梔子、延胡索單味藥材提取液。按1.3.3項下方法制備單味藥材供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3.5 樣品的測定 取混合對照品溶液、單味藥材供試品溶液及9批清胰Ⅱ號湯劑供試品溶液，按1.3.1項下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣 6 次，測得 HPLC 圖，以梔子苷成分的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明各共有峰的相對保留時間RSD為0.10%～0.37%，相對峰面積 RSD為0.51%～9.33%，表明儀器精密度良好。

2.2 重復(fù)性試驗 制備同一批號供試品溶液 6份，進(jìn)樣測定，結(jié)果表明各共有峰的相對保留時間RSD為0.03%～1.63%，相對峰面積 RSD為0.71%～7.95%，表明供試品處理方法重現(xiàn)性良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗 同一供試品溶液，分別在 0、3、6、 9、 12、 24、36 h進(jìn)樣測定，結(jié)果表明各共有峰的相對保留時間RSD為0.02%～0.84%，相對峰面積 RSD為0.86%～8.34%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 參照峰的選擇 在HPLC圖譜中26.173 min的色譜峰的峰面積最大且穩(wěn)定，經(jīng)與對照品對照鑒定為梔子苷，故選擇其為參照峰 (見圖1和圖2)。

圖1 混合對照品色譜圖

圖2 9批清胰Ⅱ號湯HPLC 特征譜圖(S1～ S9)和對照指紋圖譜(R)

2.4.2 相似度分析 將9批清胰Ⅱ號湯的HPLC圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件，以S1為參照圖譜，多點校正后自動匹配，生成對照圖譜(R)，結(jié)果見圖2。計算指紋圖譜和對照圖譜的相似度，結(jié)果見表1，可見9批樣品相似度均在0.9以上，表明各批樣品與對照指紋圖譜有良好的相似性。對共有峰進(jìn)行編號，以11號色譜峰(梔子苷)為參照峰，其保留時間和峰面積為1，計算其他各共有峰的平均相對保留時間和平均相對峰面積，其結(jié)果見表2。

表1 9批清胰Ⅱ號湯相似度結(jié)果

批號S1S2S3S4S5S6S7S8S9RS11.0000.9930.9471.0001.0000.9960.9990.9980.9240.998S20.9931.0000.9570.9950.9930.9900.9940.9910.9360.997S30.9470.9571.0000.9480.9460.9210.9460.9300.9970.963S41.0000.9950.9481.0001.0000.9960.9990.9980.9260.999S51.0000.9930.9461.0001.0000.9960.9990.9980.9230.998S60.9960.9900.9210.9960.9961.0000.9970.9990.8920.991S70.9990.9940.9460.9990.9990.9971.0000.9990.9220.998S80.9980.9910.9300.9980.9980.9990.9991.0000.9030.994S90.9240.9360.9970.9260.9230.8920.9220.9031.0000.943R0.9980.9970.9630.9990.9980.9910.9980.9940.9431.000

表2共有峰平均相對保留時間和相對峰面積

峰號平均相對保留時間RSD(%)平均相對峰面積RSD(%)峰號平均相對保留時間RSD(%)平均相對峰面積RSD(%)10.362 0.780.13012.97222.174 0.260.01618.4120.477 0.260.0119.24232.230 0.490.02410.0830.533 0.210.03317.59242.318 0.820.01721.7040.565 0.200.03517.99252.451 0.260.02728.4550.586 0.180.0097.12262.665 0.440.00916.1860.598 0.220.0108.94272.867 0.260.00614.8370.609 0.440.01113.53283.197 0.260.03918.4880.681 0.230.0235.76293.233 0.250.01012.8990.791 0.330.04713.00303.316 0.270.04915.28100.808 0.240.05616.63313.560 0.280.04656.98111.001 0.231.0000.00323.667 0.270.0543.71121.140 0.260.2389.46333.774 0.270.00619.81131.281 0.290.8169.57343.877 0.270.01426.84141.485 0.300.01126.89354.249 0.280.00417.13151.675 0.320.01613.63364.389 0.390.01427.32161.711 0.300.04610.93374.609 0.260.03117.33171.799 0.381.49028.10385.070 0.270.00314.43181.915 0.290.04310.63395.146 0.280.01626.48191.947 0.240.0379.70405.245 0.280.00330.90202.042 0.250.0159.19415.310 0.280.03730.20212.117 0.390.03225.48425.3960.280.00623.94

2.4.3 共有峰歸屬分析 取單味藥湯劑和清胰Ⅱ號湯劑供試品溶液進(jìn)行測定，得色譜圖(見圖3)。通過保留時間和紫外吸收光譜圖比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清胰Ⅱ號湯的共有峰中2、3、4、5、6、7、10、11、15 、19、20、25、26、27、35 號峰來源于梔子，12 號來源于赤芍，共有峰 16、18 、24、28、29、30、33、34、37、38、42 號來源于大黃，23號來源于延胡索，31 號來源于丹皮，36、39、41 號來源于厚樸，40 號來源于木香，1號來源于梔子和赤芍，8、22號來源于梔子和大黃，9號來源于丹皮、木香和厚樸，14號來源于丹皮、大黃和厚樸，13、17、21、32號來源于赤芍和丹皮。經(jīng)鑒定 11、13、23、31、36、37、38、39、40、41、42號峰分別為梔子苷、芍藥苷、延胡索乙素、丹皮酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、和厚樸酚、去氫木香烴內(nèi)酯、厚樸 酚、大黃酚，芒硝對共有峰沒有貢獻(xiàn)。

圖3 清胰Ⅱ號湯和各單味藥材的HPLC圖譜

3 討論

本實驗采用 DAD檢測器在220～400 nm范圍進(jìn)行全波長掃描，考察了220、230、254、280、300、400 nm 等波長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，波長大于280 nm后梔子苷無紫外吸收，經(jīng)比較后237 nm下色譜峰最為豐富，各色譜峰之間分離度良好，強度較大且均勻，基線平穩(wěn)，因此選擇 237 nm 為最佳檢測波長。在研究中發(fā)現(xiàn)，供式品溶液中的成分在 150 min 之前出峰完全，150 min 之后無色譜峰的出現(xiàn)，因此檢測時間定為150 min。

對9批清胰Ⅱ號湯劑 HPLC 圖譜進(jìn)行匹配，標(biāo)定了42個共有峰，并通過與對照品、單味藥湯的保留時間和紫外光譜圖比對，對所有共有峰進(jìn)行了組方藥味歸屬分析，指認(rèn)了其中11個成分。9批樣品在對照品木香烴內(nèi)酯的出峰位置(43號峰)均未出峰，單味藥材在相同位置有出峰。劉俊紅等[13]分別考察了60、80、100 ℃加熱不同時間對木香水提液中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的影響，結(jié)果表明3個溫度下兩者含量均降低，隨著溫度的升高，時間的延長，木香烴內(nèi)酯含量顯著降低，而去氫木香內(nèi)酯略有降低；在同一時間內(nèi)， 溫度變化影響顯著，尤其在 100 ℃，加熱 1 h后木香烴內(nèi)酯的含量幾乎損失殆盡 。清胰Ⅱ號湯劑為醫(yī)院制備，單次煎煮需近300 L水，煎煮時間雖相同，相比實驗室制備單味藥材，單次提取僅100 mL水，水達(dá)到沸騰狀態(tài)所需時間更長，且使用100℃加熱濃縮，長時間高溫加熱使樣品湯劑中木香烴內(nèi)酯損失殆盡，而去氫木香內(nèi)酯受溫度影響較小，所以還能檢出。有4批樣品在大黃素甲醚的出峰位置(44號峰)未出峰，究其原因，可能是由于不同批次大黃的質(zhì)量差異造成的；大黃藥材中大黃素甲醚的含量本身較其他4種蒽醌類成分低，而大黃-赤芍、大黃-梔子、大黃-木香同煎煮會降低游離型與結(jié)合型大黃素甲醚的量[14]，導(dǎo)致有的批次大黃素甲醚含量低于檢測限；蒽醌類成分不穩(wěn)定，在煎煮濃縮過程中受溫度影響易分解；因此未納入共有峰中。

相似度評價結(jié)果表明，9批樣品的指紋圖譜相似度較高，相對保留時間 RSD 均在 1% 以內(nèi)，相對峰面積RSD為3.71%～30.90% ，丹皮酚的相對峰面積RSD 56.98%，這可能由于不同批次藥材來源和質(zhì)量不同，煎煮濃縮過程使用的是敞口鍋，溫度不易控制，而丹皮酚屬揮發(fā)油，易揮發(fā)，增加丹皮酚損失差異，造成9批樣品中丹皮酚相對峰面積差異較大。提示需進(jìn)一步控制藥材的質(zhì)量及確保煎煮濃縮時間、溫度等條件相同。

本實驗建立的HPLC方法準(zhǔn)確、可靠，對清胰Ⅱ號湯劑中的化學(xué)成分進(jìn)行相關(guān)性研究，并對部分色譜峰予以歸屬?？蛇x擇梔子苷、芍藥苷、延胡索乙素、丹皮酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、和厚樸酚、去氫木香烴內(nèi)酯、厚樸酚、大黃酚對照品標(biāo)定的11個共有峰作為清胰Ⅱ號湯劑指紋圖譜的質(zhì)控指標(biāo)。存在不能定量且分析時間長的不足，已報道文獻(xiàn)[7-8]只測定了復(fù)方中單個或幾個成分，本實驗選擇11個質(zhì)控指標(biāo)更全面，且指紋圖譜全峰能全面反應(yīng)全方成分；可為其質(zhì)量控制提供一定參考。