雌激素對小腸葡萄糖吸收的調節(jié)及機制研究

陳長梅，杜 倩，謝 睿，徐靖宇，陳遠壽

(1.遵義醫(yī)科大學 生理學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 消化內科,貴州 遵義 563099)

肥胖是21世紀最嚴重的公共衛(wèi)生流行病之一，目前已經成為全球性問題。研究發(fā)現：絕經后女性與絕經前相比，前者患肥胖的可能性增加三倍[1]。據美國膽固醇教育計劃成人治療組第三次調查報告顯示，60歲以前女性肥胖的發(fā)病率普遍低于男性，在60～69歲時發(fā)病率迅速上升，到70歲以上女性肥胖的發(fā)病率已經明顯超過同齡男性[2]。2009年關于北京市成年女性絕經前后肥胖發(fā)病情況分析結果顯示，女性在50歲之前發(fā)病率顯著低于男性，從50歲開始肥胖發(fā)病率(顯著)升高迅速，開始超過男性[3]。以上研究提示雌激素減少與女性肥胖的發(fā)生發(fā)展密切相關。

鈣離子主要通過與鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor，CaSR)結合后產生作用。CaSR是一種G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)，是調節(jié)機體內鈣離子平衡的主要受體，其介導的細胞內鈣信號參與了多種途徑影響腸道運動。例如：調節(jié)胰高血糖素樣肽1(Glucagon-likepeptide1,GLP-1)、酪酪肽(Peptide tyrosine tyrosine，PYY)以及抑胃肽等腦腸肽的釋放，以維持機體能量及葡萄糖代謝平衡[4-5]。但是目前有關雌激素-鈣敏感受體與葡萄糖吸收之間的相互關系鮮有報道。因此，在本項目中，我們研究在雌激素分泌缺失情況下，CaSR在小鼠十二指腸的表達，及其在十二指腸葡萄糖吸收中的作用，為研究雌激素對肥胖的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 4周齡SPF級C57雌鼠(重慶陸軍軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院動物中心提供)，選擇性成熟期(6周齡)C57雌鼠36只在全麻下進行假手術和去卵巢，把18只去卵巢雌性C57小鼠作為去卵巢組，18只假手術雌性C57小鼠作為假手術組。卵巢切除手術步驟：術前12 h 禁食不禁飲，按80mg/kg體重的劑量給予小鼠腹腔注射濃度為0.5%戊巴比妥鈉。小鼠麻醉后行背部切口，分離組織找到呈粉紅色桑葚樣卵巢，切除卵巢止血后把輸卵管還納入腹腔，縫合切口并涂抹金霉素眼膏，術后保暖以促進小鼠復蘇，每天涂藥以防止切口感染，待小鼠傷口完全愈合。手術2周后進行實驗。

1.2 主要實驗材料及試劑 CaSR (ab19347)和β-actin單克隆抗體購自Abcam公司，牛血清白蛋白(BSA)購自北京博奧拓達科技有限公司、封閉蛋白干粉購自武漢博士德生物技術有限公司、鼠二抗購自艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司和兔二抗購自艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司、免疫組化試劑盒購于北京博奧森生物公司，EVC4000、Ussing Chamber(美國WPI公司)，雌二醇檢測試劑盒購自北京北方生物技術研究所，氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、葡萄糖酸鈉、葡萄糖酸鉀、碳酸氫鈉、K2HPO4及 KH2PO4均購自Sangon Biotech公司，Glycine與Tris購自Biofroxx公司，SDS購自Solarbio公司。

1.3 Ussing chamber實驗

1.3.1 工作液配制 粘膜側工作液：用量筒分別量取配置好的儲備液2.3 mol/L NaCl溶液、0.5 mol/L 葡萄糖酸鈉溶液、0.104 mol/L葡萄糖酸鉀溶液、24 mmol/L MgCl2溶液、24 mmol/L CaCl2各25 mL混勻，稱取0.911g甘露醇加入上述混合液中(終濃度為10 mmol/L)，最后用超純水定容至500 mL，用100% O2充氣1 h至溶液澄清后4℃存儲備用。

漿膜側工作液：用量筒分別量取2.3 mol/L NaCl溶液、0.5 mol/L NaHCO3溶液、44 mmol/L K2HPO4/16 mmol/L KH2PO4溶液、24 mmol/L MgCl2溶液、24 mmol/L CaCl2溶液各25 mL混勻，稱取0.9g D-葡萄糖(分子量180.16)加入上述混合液中(終濃度10 mmol/L)，加超純水定容至500 mL，用混合氣體(95%O2+5%CO2)充氣1 h至溶液澄清4 ℃存儲備用。

1.3.2 實驗裝置準備 在U型裝置內加入電解質緩沖液，U型管外套中循環(huán)流動著恒溫37 ℃的水浴，以確保腸組織能夠處于合適的溫度環(huán)境中，并對電壓電極和液體阻抗進行補償，約20 min左右。預調完成后拆開小室，用三蒸水清除U型管中的電解液。

1.3.3 標本制備與檢測

1.3.3.1 取手術后2周的C57雌鼠，禁食1 h以上，采用斷頸法將小鼠處死，取出小鼠遠端十二指腸(約2 cm)和上段空腸(約2 cm)，立即放入含有1μM消炎痛的4 ℃等滲甘露醇溶液中，將腸段放置在表面放置了封口膜的平整的石蠟塊上，并用上述等滲甘露醇溶液將腸管淹沒，沿著腸系膜將腸管切開，剝離掉漿膜及肌層組織，將粘膜及粘膜下層組織固定在chamber上(有效滲透面積為0.16 cm2)，然后組裝上chamber，粘膜側(頂端側)加入10 mL粘膜側工作液,并給予連續(xù)的、均勻的100%氧氣灌注；漿膜側(基底側)加入10 mL漿膜側工作液，并給予連續(xù)的、均勻的95%氧氣+5%二氧化碳混合氣體灌注，裝上組織后每隔5 min記錄一次短路電流(short-circuit current，Isc)，穩(wěn)定15 min后，分別在粘膜側、漿膜側或者漿膜側和粘膜側予以不同的鈣通道阻斷劑預處理，繼續(xù)觀察15 min，然后在粘膜側加入20 mM葡萄糖溶液，繼續(xù)觀察30 min并記錄Isc，然后對短路電流差值(ΔIsc)進行比較，ΔIsc是裝上組織后觀察30 min加試劑處理后的峰值減去基值，基值是裝上組織后觀察30 min時的Isc值，ΔIsc值越高，葡萄糖吸收越多；反之亦然。

1.3.3.2 取6周齡正常C57雌鼠，按上述方法制備十二指腸和上段空腸粘膜及粘膜下層組織滲透膜進行Ussing chamber實驗，以chamber工作液不加入EGTA及NPS-2143作為正常組，chamber工作液加入EGTA和/或NPS-2143作為實驗組，裝上組織滲透膜后每隔5 min記錄1次短路電流(short-circuit current,Isc)，穩(wěn)定15 min后，分別在粘膜側、漿膜側或者漿膜側和粘膜側予以Ca2+螯合劑或CaSR特異性抑制劑預處理，繼續(xù)觀察15 min，然后在粘膜側加入20 mM葡萄糖溶液，繼續(xù)觀察30 min并記錄Isc，然后對短路電流差值(△Isc)進行比較。

1.4 血清中雌二醇檢測方法 經腔靜脈抽血，運用放射免疫法(Radioimmunoassay，RIA)測定雌二醇水平。測定原理：采用均相競爭原理，即標準或待測血品中的E2和一定量的125I-E2共同與限量的E2抗體在適宜條件下進行競爭性結合反應，一部分與抗體結合形成抗原-抗體復合物，而另一部分，呈游離狀態(tài)125I-E2與抗體結合的比例取決于標準或待測樣品中非標記E2的含量，非標記E2的含量越高，125I-E2與抗體結合的比例越小；非標記E2的含量越少，125I-E2與抗體結合的比例越大。用免疫分離試劑(PR)將結合部分(B)與游離部分(F)分離后，測定結合部分的放射性活度，并計算相應結合率B/B6。用已知標準E2含量與對應結合率作圖，即得標準抑制曲線，從標準曲線上查知對應結合率的樣品中E2的含量。標準范圍：5～4 000 pg/mL。

1.5 蛋白印跡實驗(Western-blot)檢測CaSR的蛋白水平 取假手術組及去卵巢組小鼠小腸組織，依次加入100 μL裂解液(PMSF和RIPA按照1∶100體積比混合)進行細胞裂解，4 ℃，12 000×g離心10 min，吸取蛋白上清溶液，保存于-80 ℃。用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。在80 V恒壓條件下電泳，肉眼觀察溴酚藍到達距離玻璃板底時停止電泳。轉膜，封閉：5%牛血清白蛋白，室溫反應2 h。一抗結合：加入一抗(CaSR按照1∶2 000稀釋)，在4 ℃反應過夜。二抗結合：放在1∶2 000倍稀釋的二抗中，室溫孵育2 h。顯色，曝光后，用ImageJ對蛋白進行定量分析，以β-actin為內參。

2 結果

2.1 檢測兩組小鼠的血清雌二醇水平 小鼠血清中雌二醇水平測定結果顯示，假手術組小鼠血清雌二醇水平為(175.74±145.56 pg/mL，n=10)，去卵巢組小鼠血清雌二醇水平為(13.12±5.14 pg/mL，n=10)，與假手術組小鼠相比，去卵巢組小鼠血清雌二醇水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 Ussing chamber檢測葡萄糖在小腸吸收的變化 實驗結果顯示：去卵巢組葡萄糖吸收升高明顯引起ΔIsc的變化(n=5，P<0.05，vs假手術組)(見圖1)。

A：Isc檢測結果；B：葡萄糖刺激前后ΔIsc的比較(n=5，與假手術組相比，*：P<0.05)。圖1 雌激素不同水平對小鼠小腸葡萄糖吸收的ΔIsc變化

2.3 Western-Blot檢測兩組小鼠小腸CaSR蛋白的表達 Western-Blot結果顯示：假手術組及去卵巢組小鼠小腸上皮組織均有CaSR蛋白表達，與假手術組相比去卵巢組小鼠小腸上皮組織CaSR蛋白表達減少，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果如圖2所示，提示雌激素缺乏會導致十二指腸CaSR表達的降低。

A：Western-Blot檢測結果；B：CaSR蛋白相對表達量分析假手術組與去卵巢組小鼠十二指腸CaSR的表達(n=4，與假手術組相比，*：P<0.05)。圖2 Western-Blot檢測各組小鼠小腸CaSR的表達

2.4 Ca2+螯合劑、CaSR特異性抑制劑對葡萄糖吸收的影響 分別在粘膜側、漿膜側、粘膜與漿膜雙側均加入EGTA(0.1 mM)及NPS-2143(30 mM)。實驗結果顯示：(1)漿膜側加EGTA(n=6，P<0.05vs正常組)和雙側加EGTA(n=6，P<0.05vs正常組)均明顯抑制葡萄糖吸收引起的ΔIsc變化，而粘膜側加EGTA不改變葡萄糖吸收引起的ΔIsc(n=6，P>0.05vs正常組)(見圖3A、3C)；(2)漿膜側加NPS-2143(n=6，P<0.05vs正常組)和雙側加NPS-2143(n=6，P<0.05vs正常組)均抑制葡萄糖吸收引起的ΔIsc變化，而粘膜側加NPS-2143不改變葡萄糖吸收引起的ΔIsc變化(n=6，P>0.05vs正常組)(見圖3B、3D)。

A：加入EGTA后的Isc變化；B：加入NPS后的Isc變化；C：加入EGTA后的ΔIsc變化；D：加入NPS后的ΔIsc變化(n=6，與正常組相比，*：P<0.05)。圖3 加入EGTA和NPS-2143后葡萄糖吸收的ΔIsc變化

3 討論

流行病學調查研究顯示，隨著年齡的增長，肥胖發(fā)生率迅速上升，與絕經前女性相比，絕經后女性肥胖發(fā)生率增加了3倍[2-3]，提示雌激素分泌減少可能是導致女性絕經后肥胖比率增高的主要原因。

我們團隊前期的研究發(fā)現雌激素能夠參與調節(jié)十二指腸粘膜上皮細胞的氯離子、碳酸氫鹽及鈣離子的分泌[6-7]。在早期的研究中，Ghijsen等[8]在切除了卵巢的小鼠模型中發(fā)現手術組小鼠血清雌激素水平明顯下降，進而導致小腸Ca2+吸收減少。我們的研究證實了Ghijsen等的研究成果，發(fā)現去卵巢組葡萄糖吸收引起的ΔIsc變化明顯高于假手術組，提示雌激素可能參與小腸葡萄糖吸收的轉運過程，這個轉運過程與雌激素分泌高低密切相關。最近一項研究[9]發(fā)現，去卵巢會引起大鼠甲狀旁腺中CaSR的表達量顯著降低，而預防性注射β-雌二醇會使甲狀旁腺中CaSR的表達量顯著升高，提示雌激素可以調節(jié)甲狀旁腺中CaSR的表達。本研究證實，在卵巢切除后的小鼠中，小腸上皮組織中CaSR的表達相對于在正常小腸上皮組織中的表達明顯降低，這一結果提示雌激素分泌缺乏能影響小鼠小腸上皮CaSR的表達。

眾所周知，CaSR最早是1993年從牛甲狀旁腺中克隆和分離出來的，是G蛋白偶聯家族中的成員之一，主要包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內區(qū)三個獨立的區(qū)域[10]。CaSR激活后，會促進細胞內鈣活化，從而激活胞內下游信號通路，發(fā)生相關生物學行為[11]。早期的研究發(fā)現，CaSR位于甲狀旁腺細胞表面，能夠感應細胞外Ca2+濃度的細微變化，從而快速調控甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)的分泌，同時，雌激素也能通過相對應的細胞受體系統(tǒng)影響PTH的表達及分泌[12]。1993年，Mckane等的研究發(fā)現，雌激素缺乏會導致腸鈣吸收降低，PTH分泌增多，進而影響CaSR的表達[13]。有文獻報道，鈣離子參與小腸上皮細胞的生物學行為，其主要來源是漿膜側鈣流入[14]，而我們的研究發(fā)現，CaSR在小腸粘膜側及漿膜側均有表達，但主要表達在漿膜側[15]。目前，有關CaSR與葡萄糖吸收之間的研究還鮮有報道。為了證實CaSR在小腸上皮組織葡萄糖中的調節(jié)作用，我們運用Ca2+螯合劑EGTA及CaSR阻斷劑NPS-2143進行Ussing chamber實驗，結果發(fā)現：加入EGTA及NPS-2143后，葡萄糖介導的ΔIsc顯著降低，提示鈣敏感受體及其介導的鈣信號可能參與了葡萄糖的吸收。但是目前還沒有證據直接證實鈣敏感受體及其鈣信號直接參與葡萄糖的吸收，那么鈣敏感受體及其介導的鈣信號是如何參與調控葡萄糖吸收的呢？有文獻報道，葡萄糖的吸收主要依靠頂端細胞膜上Na+/葡萄糖同向轉運蛋白(Sodium-dependent glucose transporters 1，SGLT1)及基底細胞膜上的葡萄糖轉運蛋白(Glucose transporter 2，GLUT2)介導[16]。隨著腸腔葡萄糖濃度升高，葡萄糖與鈉離子經由細胞膜上的SGLT1共同轉運至小腸粘膜上皮細胞內導致細胞膜去極化，使Cav1.3通道開放，促使Ca2+內流，細胞內Ca2+濃度的增加激活了細胞內肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light chain kinase ，MLCK)，從而使終末網周圍鏈接肌球蛋白環(huán)上肌球蛋白輕鏈Ser19磷酸化，導致細胞周圍連接肌動蛋白環(huán)收縮及細胞骨架重排，導致GLUT2從終末網順利易位到小腸粘膜上皮細胞頂膜而參與葡萄糖吸收[17-18]。除此以外，激活鈣調蛋白(Calmodulin，CaM)與鈣調蛋白依賴蛋白激酶β(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ CaMKKβ)[19]。CaMKKβ使腺苷酸激活蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)和AMPK下游的?；o酶A羧化酶(acyl coenzyme A carboxylase， ACC)磷酸化，從而激活AMPK[20-21]。有研究報道，激活的AMPK通過參與調節(jié)小腸粘膜上皮細胞頂膜上GLUT2 和(或)SGLT1的表達進而調節(jié)小腸道葡萄糖的吸收[22-23]。因此我們有理由認為，CaSR介導的鈣信號也參與了對GLUT2 和(或)SGLT1的調節(jié)，進而影響了葡萄糖的吸收。

綜上所述，我們的結果首次證實了雌激素對小腸葡萄糖吸收的影響，即雌激素分泌減少可以促進小腸對葡萄糖的吸收，并且這一過程主要是通過調節(jié)對CaSR在小腸上皮細胞上的表達及功能來實現的，這為我們進一步研究女性絕經后肥胖的發(fā)生提供了新的理論基礎。