創(chuàng)傷弧菌浸泡感染對孔雀魚的影響

陳秀霞 池洪樹 許斌福 陳晨汐 方冬蘭 龔 暉

(福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所 福州 350003)

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）是海水魚的主要致病菌，可導致鲆鰈魚、軍曹魚、石斑魚以及養(yǎng)殖在含鹽水體中的鰻鱺、羅非魚等魚類發(fā)病[1-5]，研究該菌與宿主的互作關(guān)系，是研發(fā)創(chuàng)傷弧菌病防控技術(shù)的關(guān)鍵。由于養(yǎng)殖的宿主魚個體差異大，基因背景未完全明晰，且常有創(chuàng)傷弧菌感染的背景，用養(yǎng)殖的宿主魚為對象開展研究，得到的結(jié)果未必可靠，因此，有必要通過基因背景明晰的模式魚開展相關(guān)研究。

孔雀魚（Poecilia reticulate,Guppy）隸屬于硬骨魚綱 （Class Actinopterygi）、形目 （Order Cyprinodontiformes）、 花科 （Family Poecili dae）、 花屬（Genus Poecilia）。孔雀魚對鹽度具有廣適性，可適應海水和淡水[6]，近年來，孔雀魚的全基因組測序已完成[7]，因此，孔雀魚具有同時作為海水和淡水病原菌實驗模型的潛力。目前還鮮見將其用于水產(chǎn)病原學和免疫學的研究報道。

本研究將創(chuàng)傷弧菌以浸泡的方式感染孔雀魚，評價其對孔雀魚的致病力，同時，對感染后孔雀魚鰓免疫相關(guān)因子的表達情況進行分析，以期建立以孔雀魚為模式動物的海水病原菌感染模型和免疫研究模型。

1 材料與方法

1.1 材料 孔雀魚（1.0±0.2 g）來源于天津水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，購自福州市花鳥市場。創(chuàng)傷弧菌FJ03-5X由福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所分離保藏[8]。

1.2 孔雀魚的飼養(yǎng) 孔雀魚用淡水暫養(yǎng)于水體體積為200 L的PVC桶中，水溫25.0±0.5℃，溶氧6.0±0.3 mg/L，pH 值 7.5±0.3， 每天采用商品化餌料（Sera vipan staple diet D52518）投喂2次，投餌率1%。經(jīng)過2周暫養(yǎng)后，添加人工海鹽，使其鹽度為15‰，再經(jīng)1周暫養(yǎng)，添加海鹽，使其鹽度達到30‰。

1.3 感染試驗

1.3.1 感染魚分組 孔雀魚在鹽度為30‰的水體中暫養(yǎng)1周后，隨機分成4組，每組60尾，分別暫養(yǎng)于水體體積為100 L的PVC桶中，再經(jīng)1周暫養(yǎng)，用于感染試驗。

1.3.2 菌株培養(yǎng) 將創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X接種于TSA培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落，接種于10 mL TSB培養(yǎng)液，于28℃、160 r/min培養(yǎng)12 h后，取1 mL接種于100 mL TSB培養(yǎng)液；160 r/min培養(yǎng) 12 h后，28℃培養(yǎng) 12 h，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，棄上清，沉淀用0.75%生理鹽水洗滌2次后，采用平板計數(shù)結(jié)合MeFarland比濁法，將菌用0.75%生理鹽水重懸至1.0×109CFU/mL，備用。

1.3.3 浸泡感染 將創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X菌液用生理鹽水稀釋，將孔雀魚在3 L、鹽度為30‰的水體中以不同濃度的菌液進行浸泡感染5 h，之后補充水體體積至100 L，持續(xù)觀察。各組的浸泡濃度見表1。

表1 各浸泡組菌液濃度

1.4 創(chuàng)傷弧菌感染后相關(guān)基因的表達分析

1.4.1 樣品采集 在浸泡感染15 d后，將菌液濃度為3.3×107CFU/mL的浸泡組和生理鹽水對照組的孔雀魚各取7尾，采集鰓絲用于相關(guān)基因的表達分析。

1.4.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol Reagent（Invitrogen）試劑盒，按說明書提取鰓絲總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應按試劑盒PrimeScript RT reagent Kit（Takara）說明書操作，產(chǎn)物cDNA置于-20℃保存。

1.4.3 熒光定量PCR 采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPDH）基因為內(nèi)參基因，檢測C3補體、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素 10（Interleukin 10，IL-10）、 白介素 1 （Interleukin 1，IL-1）、Mx 蛋白（Mx-like）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、凋亡因子FAS和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的表達情況，根據(jù)NCBI已報道的相關(guān)序列設(shè)計引物。引物由上海生工生物有限公司合成，序列見表2。內(nèi)參基因與目的基因各設(shè)3個平行反應管。

表2 用于qPCR的引物

反應體系為 25 μL，其中 12.5 μL SYBR Premix Ex Taq（Takara），上下游引物各 0.5 μL，稀釋 10 倍的cDNA 4 μL，加水至25 μL。實時熒光定量PCR在Bio-Rad公司的CFX-96上完成。反應條件為95 ℃、90 s 后 ，95 ℃、5 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s，40個循環(huán)，用比較 CT 方法(2-△△CTmethod)分析基因表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X對孔雀魚的致病力 試驗魚死亡集中在浸泡后的前4 d，4 d后試驗魚趨于平穩(wěn)，未再出現(xiàn)死亡。至感染后第15 d，菌液濃度為3.3×108CFU/mL的試驗組死亡率為40%，菌液濃度為3.3×107CFU/mL的試驗組死亡率為18.33% ，菌液濃度為3.3×106CFU/mL的試驗組死亡率為13.33%，對照組死亡率為6.67%。說明創(chuàng)傷弧菌以浸泡的方式感染孔雀魚可導致孔雀魚致病。具體結(jié)果見圖1。

圖1 創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X浸泡感染后各組魚的死亡曲線

2.2 創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X感染后相關(guān)基因的表達情況 濃度為3.3×107CFU/mL的創(chuàng)傷弧菌浸泡組在感染15 d后，與免疫相關(guān)的腫瘤壞死因子（TNF），Mx因子表達水平均顯著高于生理鹽水對照組 （P＜0.05），白介素 10（IL-10）的表達水平與生理鹽水對照組無明顯差異 （P＞0.05），而超氧化物歧化酶（SOD）、白介素1（IL-1）的表達水平顯著低于生理鹽水對照組（P＜0.05），與細胞凋亡相關(guān)的凋亡因子FAS和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的表達水平高于對照組（P＜0.05）。見圖2。

3 討 論

水體是水產(chǎn)病原傳播的主要媒介，將病原以浸泡的方式感染宿主魚所獲得的數(shù)據(jù)能較真實地反映出臨床的實際情況。郭羿等用殺鮭氣單胞菌以創(chuàng)傷浸泡的方式感染大菱鲆致病，對體長10～15 cm的大菱鲆LD50為6.3×104CFU/mL[9]。許斌福等用惡臭假單胞菌浸泡感染大黃魚，可使大黃魚致病，感染魚的肝、脾等內(nèi)臟器官出現(xiàn)了與臨床一致的白色結(jié)節(jié)，但單純的浸泡不易使魚致病[10]。本研究直接用創(chuàng)傷弧菌浸泡感染可使孔雀魚致病，說明創(chuàng)傷弧菌對孔雀魚具有較強的致病力。

圖2 浸泡感染后相關(guān)因子的表達情況

養(yǎng)殖水體中水產(chǎn)病原菌含量不高，且細菌性疾病發(fā)病時的臨床表現(xiàn)非急性，因此，本研究在創(chuàng)傷弧菌浸泡感染孔雀魚15 d后對較低濃度感染組與對照組的免疫及細胞凋亡相關(guān)基因表達水平進行比較，以期能獲得接近臨床的數(shù)據(jù)，為進一步開展創(chuàng)傷弧菌與宿主魚的互作關(guān)系提供依據(jù)。

鰓是魚對外進行物質(zhì)交換的主要器官，鰓是病原侵染的主要部位，同時鰓在魚類的非特異性免疫和特異性免疫中也發(fā)揮著重要作用[11]。陳營等用綠色熒光蛋白標記的嗜水氣單胞菌示蹤異育銀鯽對顆粒性菌體抗原的吸收途徑，結(jié)果表明鰓對抗原的吸收率高于體表和腸道[12]。Moore J D等用BSA乳膠顆粒浸泡虹鱒，發(fā)現(xiàn)鰓上抗原顆粒主要是由吞噬細胞攝取的，攝取的抗原在鰓中至少滯留24 d，并可向頭腎和脾臟轉(zhuǎn)移[13]。魚類的鰓存在由巨噬細胞、粒細胞、淋巴細胞組成的黏膜相關(guān)淋巴組織[14]，可獨立完成免疫應答。因此，基于鰓的重要性，本研究以鰓為研究對象，對創(chuàng)傷弧菌侵染后相關(guān)因子的表達水平進行分析。在感染15 d后，腫瘤壞死因子（TNF）、Mx因子、與細胞凋亡相關(guān)的凋亡因子FAS和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的表達水平高于生理鹽水對照組，說明在感染15 d后，感染魚仍存在炎癥反應。炎癥反應之所以能維持15 d，可能與創(chuàng)傷弧菌的持續(xù)感染有關(guān)。

本研究建立了創(chuàng)傷弧菌對孔雀魚的浸泡感染模型，掌握了創(chuàng)傷弧菌浸泡感染對孔雀魚的致病力數(shù)據(jù)，初步了解了創(chuàng)傷弧菌浸泡感染對鰓免疫及凋亡因子表達的影響，為今后進一步開展創(chuàng)傷弧菌與宿主魚的互作關(guān)系研究提供了理論依據(jù)，同時為開展其他水產(chǎn)病原相關(guān)的研究提供了參考。