脫細(xì)胞生物材料樣品的細(xì)胞毒控制技術(shù)研究

楊利霞,謝美娜,王云澤,于月欣,樊立濤,楊國(guó)峰,李 晶*

(1.河北愛能生物科技股份有限公司研發(fā)部,中國(guó)河北石家莊050092；2.南開大學(xué)-河北愛能生物科技股份有限公司生物醫(yī)學(xué)材料聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)河北石家莊050092)

細(xì)胞毒性試驗(yàn)是指應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法,通過檢測(cè)材料本身或者其浸提液對(duì)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量等生長(zhǎng)情況的影響來評(píng)價(jià)材料毒性,可以直觀地看到外來因素作用后細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變以及細(xì)胞增殖與死亡的情況,是檢測(cè)生物相容性的一種快速、價(jià)廉、重復(fù)性好的方法[1]。細(xì)胞毒檢測(cè)是最敏感的生物學(xué)試驗(yàn)之一,也是動(dòng)物源性醫(yī)用材料生物安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)基本指標(biāo)。

動(dòng)物源性生物材料本身含有的多種生物大分子和加工過程中所使用化學(xué)助劑的殘留等均有可能導(dǎo)致最終樣品的細(xì)胞毒性升高。所有植入類的生物材料樣品必須通過細(xì)胞毒試驗(yàn)來初步評(píng)價(jià)其生物安全性。為此,國(guó)家出臺(tái)了《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》標(biāo)準(zhǔn)[2],使試驗(yàn)結(jié)果具有規(guī)范性、可比性。但此標(biāo)準(zhǔn)僅給出了細(xì)胞毒試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作過程,針對(duì)不同種類的生物材料尤其是動(dòng)物源性生物材料,未明確指出該如何降低材料的細(xì)胞毒水平。

動(dòng)物源性生物材料最常用的原材料有豬皮、豬心包膜、豬小腸黏膜下層以及牛心包、牛皮等組織,脫細(xì)胞是該類材料制備過程中的關(guān)鍵步驟之一。由于制備過程工序復(fù)雜、使用的加工助劑較多等,雖然在脫細(xì)胞技術(shù)制備工藝中已經(jīng)過大量磷酸鹽緩沖液的多次洗滌,但微量的分子殘留所帶來的批間差異仍可能是導(dǎo)致批間細(xì)胞毒不穩(wěn)定的原因之一。因此,樣品的細(xì)胞毒是制備過程中的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象,也是評(píng)判樣品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一。為進(jìn)一步提高并穩(wěn)定脫細(xì)胞樣品的細(xì)胞毒水平,我們?cè)黾硬?yōu)化了酒精處理工藝,最終實(shí)現(xiàn)將脫細(xì)胞樣品的細(xì)胞毒水平穩(wěn)定在Ⅰ級(jí)的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

豬脊背皮購(gòu)自石家莊雙鴿食品有限責(zé)任公司。表皮完整無破損,無明顯豬毛殘留,長(zhǎng)度20±5 cm,寬度 10±3 cm,厚度 3±0.5 mm。

其他主要材料和試劑有胰蛋白酶(Solarbio公司,美國(guó))；十二烷基硫酸鈉(SDS,北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限責(zé)任公司)；無水乙醇(石家莊新宇三陽(yáng)實(shí)業(yè)有限公司)；二甲基亞砜(DMSO,美國(guó)Sigma公司)；臺(tái)盼藍(lán)(Solarbio公司,美國(guó))；EDTA 試劑(Sigma公司,美國(guó))；DNA提取試劑盒(Qiagen公司,德國(guó))；DNA熒光定量試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；MEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國(guó))；新生牛血清(Gibco公司,美國(guó))；MTT(Sigma公司,美國(guó))；異丙醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；L929小鼠成纖維細(xì)胞(河北醫(yī)科大學(xué)免疫研究室)；高密度聚乙烯(河北醫(yī)科大學(xué)免疫研究室)。

1.2 試驗(yàn)儀器

ZWY-100H/240恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；Mettler-Toledo TCS-250型電子臺(tái)秤(梅特勒-托利多(上海)稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司)；KD-2268型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備公司)；KD-TS3D型生物組織脫水機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備公司)；KD-BMI石蠟包埋機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備公司)；KDTHIII型攤烤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備公司)；CX21/CKX53型奧林巴斯顯微鏡(奧林巴斯(中國(guó))有限公司)；XDS-1B倒置生物顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；TA.XTPlus物性測(cè)試儀(Stable Micro System公司,英國(guó))；Invitrogen細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；酶標(biāo)儀(美谷分子儀器(上海)有限公司)。

1.3 樣品制備

取剝下的豬脊背全厚皮,用取皮鼓切取厚度為0.65～0.85 mm的斷層皮片,PBS溶液振蕩清洗去除表面和皮內(nèi)血漬。將樣品置于2%的新潔爾滅溶液中振蕩清洗0.5 h,隨后轉(zhuǎn)移至含有0.25%胰蛋白酶的EDTA溶液中,10℃振蕩過夜以進(jìn)行脫細(xì)胞處理。反應(yīng)終止后,用純化水振蕩漂洗6次,每次30 min。在樣品中加入5%的SDS反應(yīng)液,常溫振蕩10 h以進(jìn)行二次脫細(xì)胞處理,隨后PBS充分漂洗以去除殘留的各種試劑及細(xì)胞碎片,最后將樣品裁剪成50 mm×80 mm大小備用。

1.4 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)共分為兩組,第一組是觀察不同酒精濃度在相同處理時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品細(xì)胞毒的影響。將上述方法制備的樣品按照質(zhì)量平均分為5組(A1、A2、A3、A4、A5),分別用相同體積的 0%、10%、30%、60%、90%酒精溶液振蕩清洗,每組清洗6次,每次30 min,每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)樣品。酒精振蕩清洗后用純水振蕩清洗6次,每次30 min,以除去酒精殘留,輻照滅菌,即為待檢樣品。

第二組觀察同一酒精濃度處理不同時(shí)間對(duì)樣品細(xì)胞毒的影響。根據(jù)第一組樣品的細(xì)胞毒檢測(cè)結(jié)果,選取細(xì)胞毒最低組別對(duì)應(yīng)的酒精濃度為最優(yōu)酒精濃度。重新取1.3中制備的樣品,按照質(zhì)量等分為 5 組(B1、B2、B3、B4、B5),每組均使用等體積的最優(yōu)濃度酒精清洗樣品,清洗時(shí)間依次為6 h、12 h、24 h、36 h、48 h,在各組清洗時(shí)間內(nèi)均等清洗6次,每組設(shè)5個(gè)重復(fù)。酒精振蕩清洗后用純水清洗6次,每次30 min,輻照滅菌,即為待檢樣品。

1.5 組織學(xué)觀察

制備石蠟切片,HE染色后,置于倒置顯微鏡下觀察,材料中的細(xì)胞被蘇木精染成藍(lán)紫色,膠原纖維被伊紅染成粉紅色[3]。

1.6 細(xì)胞毒評(píng)價(jià)

根據(jù)國(guó)家醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.5—2017/ISO 10993-5:2009,采用 MTT法對(duì)制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

浸提液的制備:按3 cm2/mL的浸提比例將樣品浸入含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基中,于37℃下浸提24 h,即得浸提液。

細(xì)胞培養(yǎng)及分組:該部分試驗(yàn)分為3組,即試驗(yàn)組(材料浸提液)、陽(yáng)性對(duì)照組(10%DMSO溶液)、陰性對(duì)照組(高密度聚乙烯,按每0.2 g陰性對(duì)照加1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液的比例,37℃浸提24 h)。采用96孔培養(yǎng)板,加入0.1 mL細(xì)胞密度為1×105/mL的L929小鼠成纖維細(xì)胞懸浮液,置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至半融合狀態(tài),吸出原培養(yǎng)基。3組分別加入0.1 mL待試液,48 h后在顯微鏡下觀察每孔的細(xì)胞形態(tài),培養(yǎng)72 h后移除培養(yǎng)液。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性:每孔加入0.05 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄孔內(nèi)液體,加入0.1 mL異丙醇,振蕩混勻后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下的吸光值。按照如下公式評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性:相對(duì)細(xì)胞增殖率(%)=樣品試驗(yàn)組吸光值/陰性對(duì)照組吸光值×100%。

1.7 細(xì)胞活率檢測(cè)

參照方法1.6,在L929小鼠成纖維細(xì)胞懸浮液中加入待試液后,共孵育24 h。每孔取20 μL細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染色后混勻加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板,避免產(chǎn)生氣泡,于細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中檢測(cè)小鼠成纖維細(xì)胞的活率。

1.8 樣品殘留DNA的提取與檢測(cè)

取待檢樣品10 mg(干重),剪碎研磨,按照DNeasy?Blood&Tissue Kit試劑盒中的操作步驟提取DNA,并按照dsDNA HS Assay Kit for Qubit?熒光定量試劑盒說明書于酶標(biāo)儀中定量檢測(cè)DNA含量,通過外標(biāo)法計(jì)算DNA濃度,DNA殘留(μg/g)=DNA濃度×反應(yīng)體積/待檢樣品干重。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品制備

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的外觀為白色或乳白色,色澤均勻,厚度為1.0～1.5 mm,無肉眼可見雜質(zhì),無毛發(fā)殘留,表面平整,觸感柔軟(圖1)。

圖1 脫細(xì)胞樣品大體外觀Fig.1 General appearance of the sample

2.2 脫細(xì)胞樣品的組織學(xué)觀察

圖2 HE染色結(jié)果(A)脫細(xì)胞前(×100)；(B)脫細(xì)胞后(×100)；(C)脫細(xì)胞前(×400)；(D)脫細(xì)胞后(×400)。Fig.2 HE staining results(A)Before decellularization(×100)；(B)After decellularization(×100)；(C)Before decellularization(×400)；(D)After decellularization(×400).

異種細(xì)胞屬于抗原性很強(qiáng)的成分,異種細(xì)胞越多,細(xì)胞毒試驗(yàn)中L929小鼠成纖維細(xì)胞受到的傷害越大,即樣品的細(xì)胞毒性越強(qiáng)。因此,高效脫細(xì)胞是保證細(xì)胞毒性合格的前提,也是研究酒精對(duì)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)樣品細(xì)胞毒影響的基礎(chǔ)。組織學(xué)觀察可以比較直觀地評(píng)價(jià)樣品脫細(xì)胞的效果是否徹底,脫細(xì)胞前的HE染色結(jié)果顯示原料皮中表皮層完整,細(xì)胞外基質(zhì)中含有較多細(xì)胞,導(dǎo)致表皮及真皮層存在大面積的藍(lán)染(圖2A,C)；而經(jīng)過含有0.25%胰蛋白酶的EDTA溶液脫細(xì)胞處理后,HE染色結(jié)果幾乎無藍(lán)色,放大后亦未見藍(lán)染細(xì)胞核或細(xì)胞碎片,說明異種細(xì)胞成分已經(jīng)基本去除(圖 2B,D)。

2.3 不同酒精濃度處理的樣品細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果

不同酒精濃度處理所得樣品的浸提液與L929小鼠成纖維細(xì)胞共孵育24 h后,以臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活率。不同組別因清洗的酒精濃度不同而導(dǎo)致樣品浸提液不同,在與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),對(duì)細(xì)胞活率也會(huì)產(chǎn)生不同的影響(表1)。當(dāng)酒精濃度小于30%時(shí),細(xì)胞活率均較低,尤其是A1組,細(xì)胞活率只有68%±6%,但隨著酒精濃度的增加細(xì)胞活率明顯升高,A2組的細(xì)胞活率提升至82%±4%；當(dāng)酒精濃度超過30%時(shí),細(xì)胞活率略有降低但基本上趨于平穩(wěn),A4、A5組與A3組的細(xì)胞活率差異不大。因此,采用30%的酒精清洗樣品,其浸提液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響較小,細(xì)胞活性最高。

在細(xì)胞毒試驗(yàn)中我們也觀察到類似的結(jié)果。按照細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)(表2)[4],當(dāng)酒精濃度低于30%時(shí),制備樣品的細(xì)胞毒為Ⅲ～Ⅱ級(jí)水平,但隨著酒精濃度的升高,A1～A3組的細(xì)胞增殖率逐漸升高,A3組中部分樣品的細(xì)胞毒性甚至可以達(dá)到0級(jí)水平(表3)。倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示:A1組細(xì)胞皺縮、邊界不明顯,細(xì)胞透明度低,細(xì)胞融合狀態(tài)差；A2組較A1組的細(xì)胞狀態(tài)有所改善,細(xì)胞透明度升高,融合度上升,顯微鏡下約能鋪滿半個(gè)視野；A3組的細(xì)胞呈現(xiàn)飽滿的梭型,透明度和融合度均達(dá)到最佳狀態(tài),顯微鏡下細(xì)胞可鋪滿整個(gè)視野(圖3)。當(dāng)采用60%濃度的酒精處理樣品時(shí)(A4組),細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果中細(xì)胞的相對(duì)增殖率與A3組差別不大,細(xì)胞毒基本上可以維持在Ⅰ級(jí)水平,倒置相差顯微鏡下細(xì)胞也能鋪滿整個(gè)視野,但細(xì)胞融合度明顯不如A3組。當(dāng)處理的酒精濃度進(jìn)一步升高至90%時(shí)(A5組),對(duì)應(yīng)結(jié)果中細(xì)胞的增殖率有所下降,部分樣品的細(xì)胞毒也降至Ⅱ級(jí)水平,而且倒置相差顯微鏡下觀察到的細(xì)胞狀態(tài)與A2組類似。

綜上可知,樣品處理時(shí)所選用的酒精濃度不同,其最終的細(xì)胞毒性也不同,酒精濃度過低(如A1組)會(huì)導(dǎo)致樣品中細(xì)胞殘?jiān)?、有機(jī)大分子等可能會(huì)引起細(xì)胞毒的物質(zhì)清洗不徹底,而濃度太高會(huì)在后續(xù)的純水清洗步驟中出現(xiàn)酒精本身清除不徹底的現(xiàn)象。這兩種情況均可能導(dǎo)致試驗(yàn)細(xì)胞的損傷。因此,選擇合適的酒精濃度進(jìn)行清洗是提高并穩(wěn)定樣品細(xì)胞毒水平的重要保證。

表2 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)[4]Table 2 Classification of cytotoxic reactions[4]

以DNA分子殘留為例,進(jìn)一步驗(yàn)證酒精對(duì)大分子物質(zhì)的清除作用。文中采用熒光定量法檢測(cè)各組樣品中的DNA殘留量(表4)。結(jié)果顯示:A3組的DNA殘留量最少,與之相比,未用酒精清洗的樣品(A1組)DNA殘留較高,二者有顯著性差異。采用低濃度的酒精清洗(A2組)時(shí),DNA殘留有所下降,與A3組相比,無顯著差異；而采用較高濃度的酒精清洗(A4組)時(shí),DNA殘留反而有升高的現(xiàn)象,且結(jié)果與A3組差異顯著；進(jìn)一步增加酒精濃度(A5組),DNA殘留量與A4組相比變化不明顯。以上信息說明只有濃度適宜的酒精才更有利于樣品中DNA分子的清除,酒精濃度過低或者過高均不利于DNA分子清除,這一變化趨勢(shì)與樣品的細(xì)胞毒變化趨勢(shì)類似。

表1 不同酒精濃度處理后的樣品浸提液對(duì)細(xì)胞活性的影響Table 1 The effect of sample extracts treated with different alcohol concentrations on cell activity

DNA分子在不同物種之間的特異性較強(qiáng),是細(xì)胞毒性增高的原因之一。高濃度酒精會(huì)降低DNA分子的溶解度,樣品可能會(huì)因?yàn)榍逑床粡氐锥鴮?dǎo)致大量DNA殘留。此外,純水雖然可以高效清洗樣品表面,但對(duì)樣品內(nèi)部的滲透性清洗不如酒精溶液好,這可能是低濃度酒精比純水清洗效果更好的原因之一。

表3 不同酒精濃度處理后的樣品浸提液對(duì)細(xì)胞毒的影響Table 3 The effect of sample extracts treated with different alcohol concentrations on cytotoxicity

圖3 與不同酒精濃度處理后的樣品浸提液共孵育48 h后的細(xì)胞形態(tài)(×100)(A)A1組,細(xì)胞毒Ⅲ級(jí)；(B)A2組,細(xì)胞毒Ⅱ級(jí)；(C)A3組,細(xì)胞毒0級(jí)；(D)A4組,細(xì)胞毒Ⅰ級(jí)；(E)A5組,細(xì)胞毒Ⅰ級(jí)。Fig.3 Cell morphologies after 48 h incubation with sample extracts treated by different alcohol concentrations(×100)(A)Group A1,cytotoxic classⅢ；(B)Group A2,cytotoxic classⅡ；(C)Group A3,cytotoxic class 0；(D)Group A4,cytotoxic classⅠ；(E)Group A5,cytotoxic classⅠ.

2.4 以30%的酒精處理不同時(shí)間所制備樣品的細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果

基于以上結(jié)果,選取30%的酒精濃度為優(yōu)選濃度,按照不同振蕩清洗時(shí)間設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)組,各組樣品的浸提液與L929小鼠成纖維細(xì)胞共孵育24 h,檢測(cè)并記錄小鼠成纖維細(xì)胞的活率。結(jié)果如表5所示,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞活性呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì),但趨勢(shì)平穩(wěn),細(xì)胞活率變化無顯著性差異,均能達(dá)到88%以上。

從表6可知,以30%的酒精振蕩清洗所制備樣品的細(xì)胞毒基本可以達(dá)到Ⅱ級(jí)以上水平。振蕩清洗6 h時(shí),細(xì)胞的相對(duì)增殖率最高可達(dá)82.2%(B1組),樣品的細(xì)胞毒最高可以達(dá)到Ⅰ級(jí)水平。從B2～B5組的數(shù)據(jù)可以看出,當(dāng)振蕩清洗時(shí)間延長(zhǎng)至12 h以上時(shí),細(xì)胞的相對(duì)增殖率基本可以穩(wěn)定在90%以上,樣品的細(xì)胞毒性較B1組低；但隨著振蕩清洗時(shí)間的延長(zhǎng),組內(nèi)各細(xì)胞的相對(duì)增殖率差異增大,如B5組內(nèi)細(xì)胞相對(duì)增殖率最低83.6%,最高102.5%,相差超過20%。這說明在30%的酒精濃度條件下,隨著清洗時(shí)間的延長(zhǎng),雖然樣品的細(xì)胞毒整體上趨于平穩(wěn),但組內(nèi)不同細(xì)胞的相對(duì)增殖率差異開始增大。因此,使用30%的酒精清洗樣品時(shí),只有合理控制清洗時(shí)間,樣品的細(xì)胞毒性才能更加穩(wěn)定。綜合考慮樣品的細(xì)胞毒性和制備過程的經(jīng)濟(jì)性,我們認(rèn)為以30%的酒精振蕩清洗至少12 h就可以將脫細(xì)胞樣品的細(xì)胞毒穩(wěn)定在Ⅰ級(jí)水平。

表4 不同酒精濃度處理后的樣品DNA殘留情況Table 4 DNA residues of samples treated with different alcohol concentrations

表5 經(jīng)30%的酒精處理不同時(shí)間后的樣品浸提液對(duì)細(xì)胞活性的影響Table 5 The effect of sample extracts treated with 30%alcohol for different processing time on cell activity

3 討論

脫細(xì)胞生物材料具有低免疫原性、良好的生物相容性和生物可降解性等特點(diǎn),逐漸成為天然生物醫(yī)用材料研究的熱點(diǎn)。人源材料因價(jià)格較高、來源有限,且存在病毒傳播風(fēng)險(xiǎn),在臨床應(yīng)用中受到限制[5]。而動(dòng)物源性材料因取材范圍及數(shù)量可不受限制備受青睞。目前,以豬心包膜[6]、豬小腸黏膜下層[7～8]以及牛心包[9～10]等組織制備的脫細(xì)胞材料的研究已經(jīng)比較深入,但材料本身及加工過程的復(fù)雜性導(dǎo)致樣品細(xì)胞毒批間差異比較大,甚至部分批次細(xì)胞毒超過限定標(biāo)準(zhǔn)。

脫細(xì)胞生物材料經(jīng)過特殊工藝處理后,可完全除去細(xì)胞成分,只留下以膠原蛋白為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)[11～12]。這可以明顯降低由細(xì)胞膜表面抗原及細(xì)胞分泌物引起的組織排異反應(yīng)。人和豬的細(xì)胞外基質(zhì)在支架結(jié)構(gòu)、膠原排列和膠原組成等方面具有很強(qiáng)的同源性；細(xì)胞外基質(zhì)成分保守,細(xì)胞毒性低,豬皮經(jīng)過去細(xì)胞、降低免疫反應(yīng)等處理后有可能替代同種無細(xì)胞真皮基質(zhì)應(yīng)用于臨床[13～14]。但因物種的差異,動(dòng)物源性材料中殘留的一些生物大分子、加工助劑等物質(zhì),在植入人體后,可能會(huì)加重炎癥、免疫反應(yīng)等,因此,為進(jìn)一步確保植入材料的安全性,有必要改進(jìn)制備工藝,加強(qiáng)對(duì)生物大分子、加工助劑等可能引起或加重細(xì)胞毒性物質(zhì)的清除,以達(dá)到降低動(dòng)物源性醫(yī)用材料細(xì)胞毒性,提高應(yīng)用安全性的目的。

酒精分子結(jié)構(gòu)特殊,能與水以任意比互溶,既能溶解無機(jī)鹽等無機(jī)物,又可以溶解脂類等有機(jī)物。酒精振蕩清洗可以減少脫細(xì)胞基質(zhì)中加工助劑、細(xì)胞碎片、生物大分子等有毒有害物質(zhì)的殘留,但酒精清洗過后,即便是多次純水清洗,也不可避免地會(huì)有酒精殘留,且在相同清洗條件下使用酒精濃度越高最終的酒精殘留也越多。相關(guān)研究報(bào)道微量酒精雖然在某種程度上可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[15],但濃度超過一定限度時(shí)會(huì)有細(xì)胞毒性,酒精可以自由擴(kuò)散出入細(xì)胞膜影響細(xì)胞膜通透性,而且其代謝產(chǎn)物含有醛基,殘留過量可能會(huì)對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒害作用,高濃度的酒精還可以使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)脫水變性?；谶@一原理,有研究者應(yīng)用酒精誘導(dǎo)加快細(xì)胞凋亡[16],臨床上也用高濃度的酒精治療卵巢囊腫類疾病[17～18]。此外,有研究報(bào)道當(dāng)酒精濃度超過一定限度時(shí),血細(xì)胞遭到破壞的程度會(huì)隨著酒精濃度的增加逐漸增強(qiáng)[19]。因此,選擇恰當(dāng)?shù)木凭幚頋舛?對(duì)降低植入材料的細(xì)胞毒至關(guān)重要。

表6 經(jīng)30%的酒精處理不同時(shí)間后的樣品浸提液對(duì)細(xì)胞毒的影響Table 6 The effect of sample extracts treated with 30%alcohol for different processing time on cytotoxicity

總的來講,只有適度的酒精振蕩處理才有利于降低脫細(xì)胞材料的細(xì)胞毒性。本研究證實(shí)采用30%的酒精振蕩清洗脫細(xì)胞樣品12 h,可將脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料的細(xì)胞毒性穩(wěn)定在Ⅰ級(jí)水平。這有利于提高脫細(xì)胞材料的生物相容性和應(yīng)用安全性,但該結(jié)論還需要?jiǎng)游镌囼?yàn)再驗(yàn)證。