桑葉乙醇提取物的體外抗氧化與抑菌活性

高欣妍， 王海英*， 劉志明

(1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱150040； 2.東北林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱150040)

桑(MorusalbaL.)是一種多年生落葉喬木或灌木，蕁麻目桑科桑屬(Morus)[1]。桑作為具有經(jīng)濟(jì)效益的古老樹種之一，不斷被人類篩選并培育。桑屬有約16種，我國約有11種，常見并普遍利用的包括雞桑、魯桑、山桑等幾個(gè)桑種，東北、西南和西北各省均有桑樹種植基地[2-3]。桑葉、桑椹、桑白皮、桑枝、桑木等均可利用。其中，桑葉為國家衛(wèi)生部藥食同源名錄的品種，來源于植物桑(M.alba)[4-6]，桑葉在飲品方面可做桑葉茶、桑葉飲料等[7-8]，目前市場上還有桑葉米酒和桑葉啤酒等酒制品[9]，在食用方面，桑葉還被制成桑葉鮮菜和桑葉菜干銷售[10]。桑葉含有生物堿類化合物、黃酮類化合物、多糖類化合物等，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抑菌和增加機(jī)體免疫力等功效[11-13]，因此也被應(yīng)用于保健品和藥物中，用于治療糖尿病和防治粥樣動(dòng)脈硬化等疾病[14-15]。薛婷婷等[16]采用乙醇浸提法提取新鮮桑葉中的1-脫氧野尻霉素，較佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，pH值3.5，料液比1∶11(g∶mL)，水浴溫度55 ℃，經(jīng)檢測此方法獲得的桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素質(zhì)量濃度為0.028 g/L，1-脫氧野尻霉素得率為0.065%。桑葉提取物作為一種純天然植物原料，具有抗氧化與抑菌活性良好的優(yōu)點(diǎn)，本研究以桑葉為原料，乙醇為溶劑，測定桑葉乙醇提取物的體外抗氧化活性以及對(duì)3種常見細(xì)菌的抑菌活性，以期為桑葉中活性物質(zhì)的利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

干桑葉由黑龍江省齊齊哈爾市甘南縣甘南林場桑產(chǎn)業(yè)科技示范園提供，研磨過篩，取粒徑≤0.30 mm的部分，備用。

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)均由東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

甲醇，色譜純；鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、氯化鈉均為分析純。

722型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；索氏提取裝置，定制；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7890A-7000B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.2 桑葉乙醇提取物的制備和GC-MS分析

稱取5 g干桑葉粉末于圓底燒瓶中，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，70 ℃水浴回流浸提3 h，過濾殘?jiān)?5 ℃、0.9 kPa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓蒸餾回收乙醇至質(zhì)量恒定，得到提取物浸膏，稱量所得提取物質(zhì)量，計(jì)算得率。用甲醇將桑葉乙醇提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀對(duì)試樣進(jìn)行分析，色譜和質(zhì)譜分析條件如文獻(xiàn)[17]所示。真空干燥剩下的提取物浸膏得到桑葉乙醇提取物粉末，密封，4 ℃冷藏，備用。

1.3 桑葉乙醇提取物抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.1鐵離子還原的總還原力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[18]記載，還原性物質(zhì)會(huì)將鐵氰化鉀還原，并與三價(jià)鐵離子形成普魯士藍(lán)，普魯士藍(lán)合成量越大，則表明還原性越強(qiáng)。普魯士藍(lán)在紫外光700 nm處有吸收峰，因此吸光度與還原性強(qiáng)度成正比，吸光度越大，則表示還原性越強(qiáng)。取1 mL不同質(zhì)量濃度(4.8、3.6、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15和0.075 g/L)的桑葉乙醇提取物樣液于試管中，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值6.6)和2.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴保溫20 min，快速冷卻，再加入2.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸，離心，取上清液2.5 mL加入干燥試管，再依次加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵試劑，充分混勻，倒入比色皿，采用紫外分光光度計(jì)在700 nm下測吸光度值(無水乙醇作空白調(diào)零)。每個(gè)濃度平行操作 3 次，記錄吸光度值，取平均值。抗壞血酸作為陽性對(duì)照組，設(shè)置8組質(zhì)量濃度梯度，分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0和4.0 g/L。

1.3.2DPPH自由基清除能力測定 向試管中移取 2 mL不同濃度的桑葉乙醇提取物樣液，加入2 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH·試劑，混勻后常溫放置 15 min，轉(zhuǎn)入比色皿，測定517 nm下的吸光度值(Ai)。測量并記錄2 mL不同濃度樣液混合2 mL 無水乙醇的吸光度值(Aj)， 和2 mL 0.1 mmol/L DPPH·試劑混合2 mL 的無水乙醇的吸光度值(A0)。以 2 mL 蒸餾水與 2 mL無水乙醇混合液作空白對(duì)比。每個(gè)濃度測 3 次取平均值，抗壞血酸作為陽性對(duì)照組，濃度梯度同1.3.1節(jié)。根據(jù)以下公式計(jì)算不同濃度桑葉乙醇提取物對(duì) DPPH·的清除率(RDPPH·)：

1.4 桑葉乙醇提取物抑菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1培養(yǎng)基的制備 分別取酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、瓊脂25 g于大燒杯中，加入適量蒸餾水，攪拌均勻，定容至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌(121 ℃時(shí)滅菌30 min)，趁熱倒入9 cm培養(yǎng)皿中，厚度5 mm，靜置凝固后備用。另取一份酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉10 g，少量蒸餾水溶解，定容至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌，制成液體培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)菌液。

1.4.2菌懸液的制備 用超凈臺(tái)紫外燈滅菌30 min。取3個(gè)100 mL錐形瓶，裝入少量無菌的液體培養(yǎng)基，分別用接菌環(huán)均勻刮取少量已經(jīng)活化2～3代的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌置于錐形瓶中，封口放入搖床，160 r/min晃動(dòng)，混勻，制成含菌數(shù)約106～107CFU/mL的菌懸液。培養(yǎng)完成后，放在冰箱中備用。

1.4.3抑菌實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理 采用濾紙片法和瓊脂平板擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。將桑葉乙醇提取物配制為8個(gè)濃度梯度，將已滅菌的6 mm濾紙片分別放入8種濃度梯度的桑葉乙醇提取物樣液中浸泡1 h。移液槍取100 μL上述制備的菌懸液均勻涂抹在瓊脂平板表面，制成大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3種含菌平板。取浸泡過桑葉乙醇提取物的6 mm濾紙片貼在含菌平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿各3片浸過同一種濃度樣液的濾紙片。以蒸餾水為空白對(duì)照組。將處理過的含菌平板置于恒溫箱中，溫度控制在37 ℃，培養(yǎng)24 h后，游標(biāo)卡尺測量并記錄抑菌圈的直徑。整理數(shù)據(jù)制成表格，通過Excel和SPSS19.0計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)及顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS分析

采用索氏提取法得到的桑葉乙醇提取物為淺綠色透明液體，得率為1.80%。桑葉乙醇提取物樣品的總離子流色譜圖如圖1所示，總GC含量90.99%的化合物被鑒定，共鑒定出9種化合物，通過面積歸一化法計(jì)算出各組分的GC含量，結(jié)果如表1所示。

表1 桑葉乙醇提取物GC-MS分析

從表1可知，桑葉乙醇提取物中主要包括酯類(82.85%)、烷烴類(6.31%)、芳烴類(1.62%)、醇類(0.21%)。其中，GC含量最高的為乙酸丁酯(81.55%)，其次為十一烷(6.09%)。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1總還原力測定 鐵離子還原法(FRAP法)測定總還原力的本質(zhì)是測定樣品將Fe3+還原成Fe2+的能力，F(xiàn)e2+絡(luò)合物在700 nm紫外光照射下有吸收峰，吸光度越大，反應(yīng)出樣品總還原能力越強(qiáng)。桑葉乙醇提取物總還原力如圖2所示。

圖1桑葉乙醇提取物的總離子流色譜圖

Fig.1Totalioncurrentchromatogramofethanolextractfrommulberryleaves

圖2桑葉乙醇提取物總還原力

Fig.2Totalreducingpowerofethanolextractfrommulberryleaves

由圖2可見，吸光度值與桑葉乙醇提取物質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出良好的正向相關(guān)性，隨著桑葉乙醇提取物質(zhì)量濃度的增加，總還原力隨之增大。通過Excel擬合曲線得到回歸方程為y=0.411 3x+0.364 1，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.986 4。本次試驗(yàn)中的陽性對(duì)照組抗壞血酸總還原力在0.1～1.0 g/L質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi)與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，擬合曲線為y=0.63 1x+2.450 6，R2為0.988 9，抗壞血酸在低質(zhì)量濃度0.1 g/L時(shí)吸光度值為2.506，仍大于本次試驗(yàn)中桑葉乙醇提取物最高質(zhì)量濃度4.8 g/L時(shí)的吸光度值2.293。由數(shù)據(jù)可以看出桑葉乙醇提取物具有較好的還原能力，但仍弱于抗壞血酸。

2.2.2DPPH自由基和OH自由基清除能力 測定了桑葉乙醇提取物和抗壞血酸在體外對(duì)于常見的DPPH自由基和OH自由基的清除能力，結(jié)果如表2所示。

表2 樣品的自由基清除率

由表2可知，桑葉乙醇提取物對(duì)于DPPH自由基和OH自由基都有較好的清除能力，相同質(zhì)量濃度下，桑葉乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯高于OH自由基。根據(jù)表2數(shù)據(jù)顯示，桑葉乙醇提取物在質(zhì)量濃度大于3.6 g/L時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除能力接近于完全清除。通過SPSS19.0統(tǒng)計(jì)計(jì)算，清除DPPH自由基和OH自由基的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為73.07和104.52 mg/L。本次對(duì)照實(shí)驗(yàn)組中，抗壞血酸質(zhì)量濃度為0.2 g/L時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率即達(dá)到96.07%，質(zhì)量濃度超過1.0 g/L時(shí)清除率均在99%以上，接近于完全清除，IC50為0.02 g/L；而對(duì)羥基自由基清除率稍弱，質(zhì)量濃度為4.0 g/L時(shí)僅為59.90%，IC50為3.596 g/L。由此可見，桑葉乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除能力弱于抗壞血酸，而對(duì)羥基自由基的清除能力強(qiáng)于抗壞血酸。有待進(jìn)一步研究。

2.3 抑菌活性分析

大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，均是常見致病細(xì)菌。桑葉乙醇提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3種供試菌的抑制情況如表3。抑制率通過如下公式計(jì)算：

相對(duì)抑菌率=(處理組抑菌圈直徑-空白組抑菌圈直徑)/處理組抑菌圈直徑×100%

由表3可知，桑葉乙醇提取物對(duì)于3種細(xì)菌均有一定抑制作用，隨質(zhì)量濃度的增大，抑菌圈逐漸增大。通過SPSS19.0統(tǒng)計(jì)桑葉乙醇提取物與抑制率的關(guān)系，計(jì)算桑葉乙醇提取物對(duì)3種細(xì)菌的IC50，比較三者差異的顯著性。桑葉乙醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的IC50值分別為4.824、6.806和14.382 g/L。結(jié)果顯示，桑葉乙醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果明顯高于對(duì)大腸桿菌的抑制效果，略高于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果。在桑葉乙醇提取物質(zhì)量濃度為19.2 g/L時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌直徑分別為(15.54±0.85)、(14.03±0.11)和(11.96±0.92) mm，在桑葉乙醇提取物質(zhì)量濃度小于0.3 g/L時(shí)，對(duì)3種供試菌的抑制作用明顯減弱，幾乎沒有抑菌圈。

表3 桑葉乙醇提取物的抑菌活性

1)同行不同大寫字母表示差異顯著different uppercase letters in the same row indicated significant difference

3 結(jié) 論

3.1采用索氏提取法對(duì)干桑葉進(jìn)行提取得到乙醇提取物，并對(duì)桑葉乙醇提取物的組分進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：桑葉乙醇提取物中含有多種有機(jī)物，主要包括酯類(82.85%)、烷烴類(6.31%)、芳烴類(1.62%)、醇類(0.21%)。其中，GC含量最高的為乙酸丁酯(81.55%)，其次為十一烷(6.09%)。

3.2對(duì)桑葉乙醇提取物的總還原力以及對(duì)DPPH自由基和OH自由基的清除能力與陽性對(duì)照的抗壞血酸相比，桑葉乙醇提取物的總還原力與清除DPPH自由基的能力較弱，清除OH自由基的能力較強(qiáng)，桑葉乙醇提取物其抗氧化活性與抑菌活性均與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。桑葉乙醇提取物質(zhì)量濃度超過3.6 g/L時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到99%，其IC50為73.07 mg/L；若要達(dá)到更高的羥基清除率，則需要更大的桑葉乙醇提取物濃度，其IC50為104.52 mg/L。

3.3對(duì)桑葉乙醇提取物的抑菌效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明：桑葉乙醇提取物對(duì)3種細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草牙孢桿菌)均表現(xiàn)出了一定的抑制作用，抑菌效果隨桑葉乙醇提取物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，抑制能力為枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。桑葉乙醇提取物質(zhì)量濃度19.2 g/L下，對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈最大，抑菌圈直徑分別為(15.54±0.85)、(14.03±0.11)和(11.96±0.92) mm。桑葉乙醇提取物對(duì)3種細(xì)菌的半數(shù)抑制濃度IC50分別為4.824、6.806和14.382 g/L。