反相紙層析法分離油菜籽中脂肪酸的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

李海霞， 王 晶， 何 瑩， 曾漢來(lái)， 王學(xué)奎， 豐勝求

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 作物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 武漢 430070)

脂肪酸是由碳、氫及氧3種元素組成的一類化合物，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分，為有機(jī)體主要能量來(lái)源之一。對(duì)脂肪酸進(jìn)行分離與分析的方法有多種[1-4]，目前科研上使用較多的方法主要包括氣相色譜法[5-7]、近紅外光譜技術(shù)法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-12]等。這些方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、檢出限低、分辨率高和重復(fù)性佳，能夠?qū)χ舅徇M(jìn)行準(zhǔn)確、快速和全面的檢測(cè)。但這些方法使用的都是大型精密儀器，價(jià)格昂貴，不適宜引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生的基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中開(kāi)設(shè)了利用反相紙層析法分離油菜籽中主要不飽和脂肪酸的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。利用反相紙層析法分離和測(cè)定混合高級(jí)脂肪酸的含量是一種較成熟的方法。原理是由于脂肪酸在固定相和移動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，其在層析濾紙上移動(dòng)速率就有差異，所以層析完成后就能使混合脂肪酸各組分分開(kāi)，然后用醋酸銅處理，將脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪酸銅鹽，再用紅氨酸顯色，就可以得到藍(lán)灰色的點(diǎn)狀層析圖譜[13]。雖然反相紙層析法不能定量分析脂肪酸，但該法快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果可視性強(qiáng)，有利于學(xué)生對(duì)脂肪酸基本理論知識(shí)的理解，比較適合于人數(shù)較多又有一定學(xué)時(shí)限制的本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

按照實(shí)驗(yàn)操作步驟[13]，樣品經(jīng)過(guò)制備(皂化和酯化)、點(diǎn)樣、展開(kāi)和顯色后，理想的結(jié)果是在層析紙上出現(xiàn)比較清晰的3～5個(gè)相互分離的藍(lán)灰色斑點(diǎn)(圖1)。然而在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中由于受到多種因素的影響，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問(wèn)題，尤其是脂肪酸層析圖譜分不開(kāi)的問(wèn)題——拖尾現(xiàn)象(圖1-D)，即各斑點(diǎn)之間界線不明，或者根本沒(méi)有界線，導(dǎo)致老師及學(xué)生具有一定的失敗感。經(jīng)過(guò)多年大量的實(shí)驗(yàn)摸索，不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使反相紙層析法在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中取得了較滿意的結(jié)果。現(xiàn)將經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行如下總結(jié)。

A：高芥酸油菜；B：低芥酸油菜；C：層析圖譜傾斜；D：拖尾現(xiàn)象。1：亞麻酸；2：亞油酸；3：油酸；4：二十碳烯酸；5：芥酸

圖1油菜籽中主要不飽和脂肪酸反相紙層析圖譜

Figure 1 Reversed-phase paper chromatogram of main unsaturated fatty acids from rapeseed

1 層析紙制作

先將新華1號(hào)層析濾紙裁成15 cm×15 cm大小，然后將一定濃度的液體石蠟-石油醚溶液倒入瓷盤內(nèi)，再將裁好的濾紙?jiān)谌芤褐型线^(guò)，浸透后立即取出，晾干即可。雖然處理好的濾紙可以存放，但不宜超過(guò)兩個(gè)星期。

在層析紙制作時(shí)應(yīng)注意，每次只能處理1～2張濾紙，且濾紙?jiān)谝后w石蠟-石油醚溶液中的操作要快，一定不能浸泡，由于石油醚具有揮發(fā)性，這樣操作會(huì)使濾紙上的液體石蠟的濃度不均一，而導(dǎo)致同一批次處理的層析紙層析效果不穩(wěn)定而變差。

通過(guò)6%、8%、10% 等不同體積濃度的液體石蠟-石油醚溶液(如配制100 mL 6%液體石蠟-石油醚溶液配方是：6 mL液體石蠟+ 94 mL石油醚)處理濾紙的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)6%濃度處理的濾紙雖然層析速度較快，但層析效果不是很好，10%濃度雖然層析效果不錯(cuò)，但層析速度較慢，綜合起來(lái)8%濃度層析效果最佳，層析時(shí)長(zhǎng)為1.5～2 h，適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)學(xué)時(shí)安排。因而在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中選擇用8%濃度的液體石蠟-石油醚溶液處理濾紙。

文獻(xiàn)[14]報(bào)道用沸點(diǎn)60℃～90℃的石油醚代替30℃～60℃ 的石油醚處理層析紙更經(jīng)濟(jì)。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用60℃～90℃ 的石油醚配制的500 mL 8%液體石蠟-石油醚溶液可以制作80～90張層析紙，而用30℃～60℃ 的石油醚配制的僅可以制作50～60張。此外，用60℃～90℃的石油醚處理的層析紙層析效果較穩(wěn)定，因?yàn)樗膿]發(fā)速度比30℃～60℃ 的石油醚慢，使層析紙上的石蠟分布比較均勻。因此，在處理層析紙時(shí)采用沸點(diǎn)60℃～90℃代替30℃～60℃的石油醚。

2 樣品制備

2.1 樣品皂化和酯化

干燥的油菜籽磨碎后，以8∶1(V/W)的比例加入5%KOH溶液，放置2～3 d，使樣品充分皂化和酯化，用以提取脂肪并使其轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯。使樣品皂化和酯化的試劑配方一般用5% KOH 甲醇溶液。因?yàn)?5%乙醇比甲醇毒性小，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，用5 g KOH+100 mL 95% 乙醇效果也不錯(cuò)，因此我們選擇了用95%乙醇配制的5% KOH溶液。另外，酯化好的樣品溶液經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明室溫下可長(zhǎng)期保存。

2.2 點(diǎn)樣液制備

在酯化好的樣品溶液中，先以2∶1(V/V)的比例加入1 mol/L鹽酸，使脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化為各種游離的脂肪酸，再以1∶1(V/V)的比例加入石油醚用于萃取脂肪酸，混勻，靜置，上層即為點(diǎn)樣液。若加入的鹽酸量不足，不能使脂肪酸甲酯充分轉(zhuǎn)化為脂肪酸[14]，就會(huì)導(dǎo)致脂肪酸層析圖譜不能完全分開(kāi)，可通過(guò)加入梯度量的鹽酸找到最適合的鹽酸用量。

點(diǎn)樣液的濃度可通過(guò)加入不同量的石油醚來(lái)調(diào)整。若后續(xù)要定量點(diǎn)樣，萃取時(shí)應(yīng)加入60℃～90℃的石油醚，因?yàn)?0℃～60℃的石油醚揮發(fā)較快，用移液器吸取微量點(diǎn)樣液后還來(lái)不及點(diǎn)樣就會(huì)揮發(fā)完。

3 點(diǎn)樣

在處理好的層析紙一端用鉛筆輕輕畫一直線，每間隔一定距離用鉛筆點(diǎn)一記號(hào)，在記號(hào)處用針刺一小孔(一定要與紙垂直穿透)，然后用移液器吸取點(diǎn)樣液 5 μL(通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的最佳點(diǎn)樣體積)，分2～3次點(diǎn)入孔洞處，斑點(diǎn)應(yīng)小而圓，直徑不能超過(guò)0.3 cm。

點(diǎn)樣技術(shù)也直接影響脂肪酸層析圖譜質(zhì)量的優(yōu)劣，以下3點(diǎn)一定要注意：1)用移液器吸取點(diǎn)樣液后應(yīng)盡快點(diǎn)樣，不要耽擱時(shí)間太長(zhǎng)，否則會(huì)出現(xiàn)沒(méi)有層析斑點(diǎn)或斑點(diǎn)太淡的現(xiàn)象；2)點(diǎn)樣液分2～3次點(diǎn)入孔洞時(shí)，斑點(diǎn)應(yīng)小而圓，而且要等前一次的點(diǎn)樣液干燥后再點(diǎn)入下一次，否則易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；3)點(diǎn)樣時(shí)，槍頭每次都要對(duì)準(zhǔn)孔洞，且槍頭與層析紙一定要垂直，否則也易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

4 展開(kāi)溶劑系統(tǒng)與條件

將點(diǎn)好樣的層析紙點(diǎn)樣面朝內(nèi)卷成筒狀，用訂書機(jī)固定兩端，使編號(hào)端朝下放入盛有95%醋酸溶液(展層劑)的層析缸中，并立即蓋好層析缸蓋子開(kāi)始層析(注意檢查密閉性)。當(dāng)展層劑前沿上升到距濾紙頂端1～2 cm處時(shí)停止層析，取出層析紙，用吹風(fēng)機(jī)吹干層析紙。

將點(diǎn)好樣的層析紙卷成筒狀并用訂書機(jī)固定時(shí)兩側(cè)不能重疊，需留有一點(diǎn)縫隙，否則層析圖譜會(huì)出現(xiàn)傾斜情況。95%醋酸溶液的多少以能夠浸泡層析紙但液面低于點(diǎn)樣處為宜，過(guò)少會(huì)使層析時(shí)間延長(zhǎng)，過(guò)多會(huì)使液面高于點(diǎn)樣處而使脂肪酸樣品溶解在展層劑中而不能層析。此外，因?yàn)榇姿嵋讚]發(fā)，用95%醋酸溶液做展層劑連續(xù)使用幾次后濃度降低，使層析速度變慢，且圖譜也易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因而針對(duì)同一個(gè)層析缸，在層析2～3次后一定要更換新的95%醋酸溶液才不會(huì)影響層析效果。

5 顯色

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們將文獻(xiàn)[13]中的1%醋酸銅溶液改成0.1%的濃度，顯色后非但沒(méi)有影響層析斑點(diǎn)的顏色，層析紙背景的顏色還變淡了，層析效果變優(yōu)，同時(shí)又節(jié)約了試劑用量。

顯色過(guò)程為將吹干的層析紙放入0.1%醋酸銅溶液中浸泡15～20 s，使脂肪酸生成脂肪酸銅鹽。先用清水沖洗，再放入潔凈的瓷盤中，用流水漂洗30 min以上。然后將層析紙小心取出，放置在潔凈的吸水紙上，用電吹風(fēng)吹干。再將吹干的層析紙?jiān)?.03%紅氨酸溶液中一帶而過(guò)，即可在層析紙上顯出藍(lán)灰色的斑點(diǎn)。高芥酸油菜有5個(gè)斑點(diǎn)(圖1-A)，從上往下分別是亞麻酸、亞油酸、油酸、二十碳烯酸和芥酸，低芥酸油菜有3 ～ 5 個(gè)斑點(diǎn)，3個(gè)斑點(diǎn)時(shí)沒(méi)有芥酸和二十碳烯酸(圖1-B)，4個(gè)斑點(diǎn)時(shí)沒(méi)有芥酸。

實(shí)驗(yàn)時(shí)脂肪酸層析圖譜容易出現(xiàn)的問(wèn)題除了拖尾現(xiàn)象，還有背景顏色過(guò)深、層析圖譜傾斜(圖1-C)等，對(duì)此進(jìn)行了常見(jiàn)問(wèn)題解析(表1)，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中能針對(duì)性解決脂肪酸層析中出現(xiàn)的問(wèn)題。

表1 反相紙層析法分離油菜籽中主要不飽和脂肪酸常見(jiàn)問(wèn)題解析

隨著信息技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)展示范性虛擬仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目建設(shè)，是提升實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量和水平的重要舉措[15]。后續(xù)我們將進(jìn)行采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)多種脂肪酸進(jìn)行測(cè)定的虛擬仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的建設(shè)，以此實(shí)現(xiàn)在“主要不飽和脂肪酸的分離”實(shí)驗(yàn)教學(xué)中采取虛實(shí)結(jié)合的方法進(jìn)一步提高基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量。