MscL通道在生物納米技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用研究

洪 朗， 李月舟

(浙江大學 醫(yī)學院， 杭州 310058)

隨著分子生物學的發(fā)展，科學家們對生物納米技術(shù)的興趣與日俱增。近些年來在生物納米技術(shù)領(lǐng)域誕生了一些新方法，比如將納米尺度的蛋白分子作為生物傳感器和分子開關(guān)，人為控制小分子化合物、特定離子等成分通過生物膜。目前已有研究使用這些小分子來參與對癌癥的診斷和治療。結(jié)合脂質(zhì)體這種人工合成的脂質(zhì)囊泡工具，科學家們由此提出了一種新的物質(zhì)運輸方法：將一種可遠程操控的蛋白質(zhì)分子開關(guān)嵌在脂質(zhì)體上，使得脂質(zhì)體內(nèi)容物可人為操控地釋放或停止釋放。而機械敏感通道，特別是大電導(dǎo)機械敏感通道，由于其性質(zhì)穩(wěn)定，易于改造，可調(diào)控性強等特點，是作為這一類分子開關(guān)最為適合的候選蛋白之一。近些年來科學家們對MscL通道進行了很多研究以發(fā)揮其作為生物傳感器和分子開關(guān)的潛力，本文旨在對近年來MscL通道在生物納米技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展進行綜述。

1 納米給藥系統(tǒng)

近些年來納米技術(shù)的發(fā)展對癌癥的治療和診斷產(chǎn)生了巨大的推進作用[1-2]，而其中最關(guān)鍵最核心的內(nèi)容就是各種納米藥物載體的發(fā)現(xiàn)，這些用作藥物載體的納米微粒直徑在50～400 nm的范圍內(nèi)，能夠方便地抵達病患處，并在特定的條件下釋放出內(nèi)容物[3]，從而實現(xiàn)抗癌藥物的定向遞送。這些納米微粒有很多類型，包括嵌合了分子開關(guān)的脂質(zhì)體，其他還有例如已經(jīng)在臨床試驗中廣泛應(yīng)用的微膠粒聚合物、經(jīng)過分枝化加工的樹枝狀大分子。在無機納米微粒中，二氧化硅介孔的納米分子、納米鉆石以及納米金分子也可用于藥物配送。此外，還有經(jīng)設(shè)計的病毒做成的病毒納米分子和穹隆體納米分子這類生物源的納米微粒。

由于腫瘤組織包含大量的脈管系統(tǒng)，只有尺寸極小的顆粒才能夠通過，因此這些納米微粒可以大量進入脈管系統(tǒng)，積聚在腫瘤內(nèi)部。除了這種被動定位方式之外，也可以通過在納米微粒表面添加特定的定位信號，如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白和RGD等腫瘤細胞表面受體相應(yīng)的配體或抗體來主動定位[4-6]。

納米給藥系統(tǒng)的另一重要特征是物質(zhì)釋放的可控制性。比如在癌癥的治療中，理想的納米給藥模型是將抗癌藥物包裹在納米微粒內(nèi)部配送到腫瘤處，當接收到釋放信號時納米微粒會將內(nèi)部的抗癌藥物釋放出來。除了抗癌藥物以外，納米給藥系統(tǒng)也可以裝載配送其他的化合物。例如裝載熒光染料來成像，或是在裝載熒光染料的同時還裝載藥物來指導(dǎo)診療的操作[7]。很多刺激因素都可以作為釋放信號來使納米微粒釋放內(nèi)容物，例如身體內(nèi)部環(huán)境中的pH和氧化還原狀態(tài)，甚至包括光和磁場刺激。在這個系統(tǒng)中，確保納米微粒到達腫瘤之前其內(nèi)容物不能釋放出來是很重要的。

2 大電導(dǎo)機械敏感性離子通道

機械敏感性離子通道(Mechanosensitive channels)是一類感知和響應(yīng)膜張力變化的膜蛋白，廣泛存在于各種生物中。機械敏感性離子通道作為一種可以將機械刺激轉(zhuǎn)換為電信號或生化信號的分子開關(guān)，參與聽覺、平衡、觸覺和疼痛等多種生理和病理活動，在骨骼、腎臟和心血管等系統(tǒng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。失調(diào)的機械敏感性離子通道涉及多種疾病，例如囊性纖維化[8]、抑郁、癲癇[9-10]，以及高血壓、心律失常、心力衰竭等心血管疾病[11-13]。機械敏感性離子通道具有獨特的對外界刺激的響應(yīng)機制，而且結(jié)構(gòu)簡單，功能穩(wěn)定，通透速度快，特別是大電導(dǎo)的機械敏感性離子通道(Mechanosensitive channel of large conductance, MscL)電導(dǎo)高達3.6 nS，通道開放形成直徑30?～40?的巨大孔徑[14]。這使得MscL在納米生物感受器方面的應(yīng)用備受關(guān)注。通過開放機制和功能修飾的研究，我們可以構(gòu)建以修飾后的機械敏感性離子通道作為分子開關(guān)的納米生物傳感器，重組脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，應(yīng)用于定位的藥物釋放，靶向的癌癥治療等。

MscL位于細胞膜上，在細胞中起到緊急閥門的作用：當細胞受到低滲刺激的時候，通道開放釋放出內(nèi)容物，減低滲透差，避免細胞因為體積的過度膨脹而破裂[15]。水分子、離子、ATP，甚至一些小的蛋白質(zhì)，都能夠通過開放的MscL通道[16]。MscL 功能穩(wěn)定，可以被表達純化并重組到人工脂質(zhì)體上并仍具有通道活性[17-18]。MscL結(jié)構(gòu)簡單，具有五聚體的結(jié)構(gòu)，每個單體包括兩個跨膜片斷TM1和TM2(transmembrane)，N-端，C-端都位于膜內(nèi)側(cè)并通過Loop區(qū)域相連。研究表明TM1是構(gòu)成通道孔徑的主要區(qū)域，而TM2則主要和膜脂質(zhì)發(fā)生相互作用并涉及對膜張力的感應(yīng)[19](圖1)。

A：MscL通道關(guān)閉和開放狀態(tài)模型，上半部分是側(cè)面視角，下半部分是周質(zhì)側(cè)視角;B：MscL蛋白一個單體的結(jié)構(gòu)示意圖，包括N端和C端的一個螺旋，兩個跨膜區(qū)域TM1和TM2以及二者之間的周質(zhì)環(huán)

圖1大腸桿菌MscL蛋白的結(jié)構(gòu)模型
Figure 1 One proposed model for the structure of theE.coliMscL protein

3 MscL通道開放調(diào)控

3.1 光調(diào)控

在已知的納米裝置中，光控分子開關(guān)具有突出地位。由于其響應(yīng)時間短和能在不同狀態(tài)中迅速、反復(fù)且可逆轉(zhuǎn)換的特性，這些分子開關(guān)可以用來調(diào)控材料的多種性質(zhì)，例如表面濕度、折射指數(shù)、雙分子膜的側(cè)面壓力分布。在分子水平還可以涉及酶的活動調(diào)節(jié)[21-22]。

將光開關(guān)用于門控離子通道是當前的一個熱點，特別是在調(diào)控離子通透和藥物釋放方面的應(yīng)用。已有研究對大腸桿菌的MscL通道蛋白進行修飾改造成分子開關(guān)，該分子開關(guān)可嵌入雙分子膜中，在光的調(diào)控下開放或關(guān)閉。

基于MscL通道的光控分子開關(guān)研究是在MscL蛋白的G22C突變體的基礎(chǔ)上進行的。MscL蛋白的第22位氨基酸位點位于TM1區(qū)域，在空間結(jié)構(gòu)上處于孔道區(qū)，點突變得到的G22C是功能獲得性突變體，即該突變體通道開放所需力的閾值相比于野生型大大降低，可自發(fā)開放。野生型MscL通道不含有半胱氨酸，因此具有半胱氨酸選擇性的光控修飾物可以特異性地結(jié)合在G22C突變體的半胱氨酸殘基上。這類光控化合物本身不帶電荷，與半胱氨酸結(jié)合后會改變G22C突變體的功能特性，使孔道區(qū)疏水性增加，使自發(fā)開放的G22C突變體通道關(guān)閉。當化合物在特定波長的光照射下，帶電性質(zhì)會發(fā)生變化，轉(zhuǎn)變?yōu)閹щ姾蔂顟B(tài)。當結(jié)合在G22C突變體上的化合物帶電荷之后，會破壞孔道區(qū)的疏水性質(zhì)，從而使G22C突變體重回自發(fā)開放的性質(zhì)[23]。

碘代乙酸4,5-二甲氧基-2-硝基芐脂是一種光照反應(yīng)不可逆的修飾物。將該化合物修飾于MscL蛋白的G22C突變體上時，原化合物上的碘原子由半胱氨酸殘基上的巰基基團取代，突變體的每一個單體修飾后通道都會因孔道區(qū)疏水性上升而關(guān)閉。經(jīng)過波長300 nm以上的光照射，該化合物會發(fā)生裂解反應(yīng)，裂解后仍修飾于半胱氨酸殘基上的殘余部分會帶負電荷。由修飾物帶負電導(dǎo)致的孔道區(qū)親水性上升使得通道可以自發(fā)開放(圖2)。

圖2 光照反應(yīng)不可逆修飾物[23]Figure 2 A irreversible modifier

注：該修飾物經(jīng)光照裂解后，修飾在通道上的殘余部分帶電荷

3′,3′-二甲基-1′-(2-羥乙酰碘)-6-硝基螺[2氫-1-苯并吡喃-2,2′-二氫吲哚]是一種光照反應(yīng)可逆的修飾物，同樣可特異性結(jié)合于半胱氨酸殘基上。該化合物有兩種狀態(tài)：不帶電荷的螺吡喃態(tài)和帶電荷的部花青態(tài)。處于螺吡喃態(tài)的化合物在波長366 nm光照下可轉(zhuǎn)化為部花青態(tài)，而部花青態(tài)在波長大于460 nm光照下可恢復(fù)為螺吡喃態(tài)。將該化合物修飾于MscL蛋白的G22C突變體上時，修飾物處于螺吡喃態(tài)則孔道區(qū)疏水，通道關(guān)閉；修飾物處于部花青態(tài)時則孔道區(qū)親水，通道開放(圖3)。因此，通過不同波長的光照，可以控制修飾物的帶電性質(zhì)，從而可通過影響通道孔道區(qū)的親疏水性來可逆地調(diào)控通道的開放或關(guān)閉。

3.2 pH值調(diào)控

在臨床中，癌癥和炎癥組織中往往pH值較低。同光調(diào)控類似，已有研究發(fā)現(xiàn)了一系列的半胱氨酸特異性結(jié)合的pH值調(diào)控化合物，這些化合物在不同pH值環(huán)境下會表現(xiàn)出不同的帶電性質(zhì)：帶正電荷、帶負電荷或不帶電荷。將這些化合物修飾在MscL蛋白的G22C突變體上，當這些pH值調(diào)控化合物不帶電荷時，并不影響孔道區(qū)疏水性，通道保持關(guān)閉，而當這些化合物帶電時，孔道區(qū)變得親水，使通道開放。這樣通過改變周圍環(huán)境的pH值就可以改變通道孔道區(qū)的親疏水性，從而調(diào)控通道的開放與關(guān)閉[24-25]。

結(jié)合光調(diào)控和pH值調(diào)控的研究，研究者還發(fā)現(xiàn)了一種特殊化合物可以起到“復(fù)合”調(diào)控的作用。[(4,5-二甲氧基-2-硝基-芐氧羰基)-甲基-氨基]-乙酸2-甲烷磺酰硫基-乙酯具有巰基選擇性，不帶電荷，可修飾在G22C突變體上使通道維持關(guān)閉狀態(tài)，經(jīng)過366 nm的紫外光照射后，該化合物會發(fā)生裂解反應(yīng)，裂解后仍修飾在G22C突變體上的殘余部分具有pH值調(diào)控化合物特性，在pH 5.7時帶正電，在pH 7.7時恢復(fù)為不帶電狀態(tài)，當其帶電荷時，可以由孔道區(qū)親水性增強的變化使得通道開放[26](圖4)。

圖3 光照反應(yīng)可逆修飾物[23]Figure 3 A reversible modifier

注：通過對光照波長的控制，該修飾物可以在帶電荷和不帶電荷的兩種狀態(tài)下自由轉(zhuǎn)換。其中螺吡喃態(tài)不帶電荷，部花青態(tài)帶電荷

圖4 “復(fù)合”調(diào)控型修飾物[26]Figure 4 A "Complex" modifier

注：這種特殊的修飾物經(jīng)光照裂解后，殘余修飾部分具有pH值調(diào)控修飾物的功能，是一種結(jié)合光調(diào)控和pH值調(diào)控的修飾物

3.3 磁力調(diào)控

磁力調(diào)控的設(shè)想源于將脂質(zhì)體類的納米給藥系統(tǒng)用于疾病治療的研究。已有研究發(fā)現(xiàn)了一種半徑小于10 nm的具有超順磁性的分子CoFe2O4具有巰基選擇性，可以結(jié)合在MscL蛋白的M42C突變體上。MscL蛋白的第42位氨基酸位于TM1區(qū)域的末端，處于膜外，M42C突變體與野生型相比在功能上沒有變化。結(jié)合磁性分子CoFe2O4后，在磁場范圍下進行實驗。在膜片水平上，開放的通道增多。在單通道水平上，通道開放的機械力閾值減小。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)了人工合成的通道蛋白分子沒有細胞毒性，進一步提出了把MscL通道蛋白的磁力調(diào)控用于脂質(zhì)體類納米給藥系統(tǒng)應(yīng)用的可能性[27]。

4 通道選擇性調(diào)控

4.1 通道孔徑調(diào)控

除了研究遠程操控通道開放，還有研究致力于調(diào)控通道開放時的孔徑大小。已有研究發(fā)現(xiàn)針對MscL蛋白TM2和CB(α helical cytoplasmic terminal bundle)的連接區(qū)域的3種突變可以改變通道開放時的電導(dǎo)大小[17]。CB區(qū)域是指MscL 5個單體中位于胞質(zhì)側(cè)的C端螺旋的聚合區(qū)域。

第1種突變方式是刪除TM2和CB連接區(qū)域的氨基酸殘基，實驗發(fā)現(xiàn)相對于野生型MscL蛋白，Δ110-112突變體開放時的電導(dǎo)輕微下降， Δ110-115突變體開放時的電導(dǎo)明顯下降。實驗還用鈣熒光染色比較了G22C突變體和G22C/Δ110-115突變體對熒光染料的釋放情況，鈣熒光染料calcein的直徑大小是小于通道孔徑的，因此可以通過通道。但實驗發(fā)現(xiàn)鈣熒光染料可以通過G22C突變體，但不能通過G22C/Δ110-115突變體，從而得出結(jié)論：刪除TM2和CB連接區(qū)域的氨基酸殘基可以減小MscL蛋白的通道孔徑。

第2種突變方式是把TM2和CB連接區(qū)域的氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，人為地制造二硫鍵形成交聯(lián)。通過Western Blot發(fā)現(xiàn)存在5條倍數(shù)于單體大小的蛋白條帶，證明二硫鍵交聯(lián)的存在，通過電生理實驗發(fā)現(xiàn)A110-112C突變體相對野生型MscL蛋白電導(dǎo)下降。對A110-112C突變體使用二硫鍵氧化劑DTT打斷二硫鍵以后電導(dǎo)會恢復(fù)到野生型MscL水平,表示該過程可逆。

第3種突變方式是在TM2和CB連接區(qū)域交聯(lián)重金屬離子。實驗發(fā)現(xiàn)，相對于野生型MscL蛋白，A110H突變體和A112H突變體僅在敏感性方面有所下降，在電導(dǎo)方面的性質(zhì)沒有變化。而加入ZnCl2后，野生型MscL蛋白電導(dǎo)沒有變化，A110H突變體和A112H突變體由于Zn2+的存在形成重金屬離子交聯(lián)，使得電導(dǎo)下降。A110H突變體和A112H突變體洗脫ZnCl2后電導(dǎo)復(fù)原。

4.2 通道離子通透能力調(diào)控

MscL通道具有較大的孔徑，沒有離子選擇性，但已有實驗表明，修飾后的MscL通道對于不同帶電分子通透性不同。實驗使用兩種具有半胱氨酸特異性的修飾物MTSET和MTSES修飾于MscL蛋白的G26C突變體[28]。第26位氨基酸位于TM1，已被證明是MscL的限制性位點，是MscL通道最窄的位置[29]。當MTSET或MTSES結(jié)合在該位點上時，MTSET帶正電，MTSES帶負電，使孔道區(qū)帶電。修飾后的G26C突變體會自發(fā)開放。

在膜片鉗實驗中，數(shù)據(jù)表明：對于琥珀酸鈉，帶負電的琥珀酸離子相比于野生型通道在MTSET修飾的通道中通透性上升，在MTSES修飾的通道中通透性下降，而鈉離子通透性無明顯變化。對于四鹽酸精胺，帶正電的精胺離子在MTSET修飾的通道中通透性下降，在MTSES修飾的通道中通透性上升，而氯離子通透性只有輕微的變化。更多的實驗證明，離子分子量越大，所帶電荷越多，就更易于由修飾后的MscL通道調(diào)控[30]。

5 總結(jié)

MscL通道具有較大的孔道直徑、簡單穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、高通透性以及直接響應(yīng)膜張力變化而開放等特點，一直以來被認為在納米科技領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，特別是作為調(diào)控離子通透、釋放小分子化合物和藥物的生物傳感器或分子開關(guān)。具有代表性的大腸桿菌MscL是一種同源五聚體蛋白質(zhì)，每個單體只有136個氨基酸[31]，是目前從結(jié)構(gòu)和功能上了解得最為透徹的機械敏感性離子通道，科學家們也已經(jīng)對多種大腸桿菌MscL突變體的通道功能性質(zhì)有了深刻認識。

對MscL通道在應(yīng)用方面的深入研究主要體現(xiàn)在兩個方面：調(diào)控通道的開放因素和調(diào)控通道的選擇性。如前文所述，已經(jīng)有實驗證實修飾后的MscL通道可以由光、pH值和磁力等因素調(diào)控。特別是光和pH值調(diào)控的研究里，G22突變體調(diào)控開放的過程是可逆的。進一步研究發(fā)現(xiàn)，相比于G22突變體，G26突變體開放狀態(tài)更穩(wěn)定，開放規(guī)模更大，是更適合用于修飾改造的突變體[32]。除了這些調(diào)控手段以外，超聲調(diào)控納米分子開關(guān)的研究前景也值得期待，相比于光、pH值和磁力這些條件，超聲是對高等生物活體更適用的刺激方式，可以在不影響機體其他生命活動的前提下直接對體內(nèi)部位給予無損刺激，調(diào)控位于體內(nèi)的分子開關(guān)[33]。此外過去也曾有提出過溫度調(diào)控MscL通道開放的設(shè)想，可惜并沒有進一步的成果發(fā)表[34]。對于通道選擇性的調(diào)控，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些MscL突變修飾的方法可以改變通道口徑大小，以及調(diào)控特定電荷離子的滲透性。同時，利用MscL重構(gòu)于脂質(zhì)體上仍有活性的特點，已有研究表明將含有MscL的脂質(zhì)體裝在硅質(zhì)的微芯片裝置表面同樣可以保留正常生理活性，這是一種初步的在非生物材料上的分子開關(guān)模型[35]。綜上所述，MscL通道是一種非常易于修飾設(shè)計的工具分子，其在生物納米技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景值得期待。