超臨界二氧化碳萃取大別山五針?biāo)舍樔~揮發(fā)油及其成分分析

項小燕， 吳甘霖， 段仁燕， 王志高， 劉家雷

(1. 安慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 安慶 246133； 2. 皖西南生物多樣性研究與生態(tài)保護安徽省重點實驗室， 安慶 246133; 3. 岳西縣林業(yè)總場， 岳西 246600)

大別山五針?biāo)?PinusdabeshanensisW. C. Cheng & Y.W. Law), 隸屬松科松屬，僅分布于我國東部大別山區(qū)900～1300 m的狹小范圍內(nèi)，野生種群僅200余株[1]。近年來，種群的保護已引起了國家相關(guān)部門及一些科研人員的關(guān)注。目前已有研究分別從花粉飛散[2]、花粉活力[3]、種間聯(lián)結(jié)和競爭[4-5]及遺傳多樣性[6]等方面對大別山五針?biāo)傻臑l危機制進行了報道。除自身生物學(xué)特性外，該物種還受到一些昆蟲的取食和危害，從而加劇了其瀕危的速度。

在正常的生理狀態(tài)下，植物會產(chǎn)生相應(yīng)的揮發(fā)物，在昆蟲尋找寄主的識別過程中起著關(guān)鍵的通訊引導(dǎo)作用，從而調(diào)控著昆蟲的寄主定向、產(chǎn)卵、逃避、取食等多種行為[7～8]。大別山五針?biāo)上x害的發(fā)生應(yīng)該有其特殊的原因，其揮發(fā)性物質(zhì)的特異組分可能是昆蟲對寄主定向選擇的重要信息物。然而，大別山五針?biāo)蓳]發(fā)油的化學(xué)成分研究尚未見報道。針葉是大別山五針?biāo)芍仓甑闹匾M成部分，因而本研究用超臨界二氧化碳萃取法提取大別山五針?biāo)山】抵赆樔~的揮發(fā)油，并進行GC-MS分析，以期為揭示昆蟲與大別山五針?biāo)傻募闹鳈C制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料的采集

2016年4月，從安徽省岳西縣大王溝大別山五針?biāo)勺匀环N群采集健康株針葉。經(jīng)安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張小平教授鑒定為大別山五針?biāo)?P.dabeshanensisW. C. Cheng & Y.W. Law)的針葉，憑證標(biāo)本保存于安慶師范大學(xué)標(biāo)本館。

1.2 超臨界二氧化碳萃取

所采集的針葉60℃烘干至恒重。將烘干的針葉粉碎過10目篩。稱取250 g粉末置萃取釜中按以下條件萃取。萃取釜壓力24 Mpa(溫度45℃)，分離釜I壓力9 Mpa (溫度40℃)，分離釜Ⅱ壓力5 Mpa(溫度35℃)，CO2流量12 L/h，萃取2 h。得精油0.59 g，得率為0.24%，所得精油置4℃避光保存待用。

1.3 GC-MS分析條件

所得精油在HP6890/5973 GC-MS聯(lián)用儀(美國，惠普公司)上進行分析，進樣量1 μL。色譜柱為石英毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，初始溫度60℃(保留5 min)，程序升溫，以10℃/min升溫至 250℃，保持18 min。載氣為高純He(99.99%)，流速1 mL/min。進樣口溫度為250℃(分流比50∶1)，檢測溫度保持在280℃。質(zhì)譜條件：離子源為EI源(70 eV)，離子源溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍為30～550 amu。將總離子流圖中各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，通過HPMSD化學(xué)工作站，結(jié)合Wiley 275和NIST 98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進行檢索，采用峰面積歸一化法計算各組分在揮發(fā)油中的相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

按GC-MS分析條件，取供試品溶液1.0 μL進樣，得超臨界二氧化碳萃取的大別山五針?biāo)舍樔~揮發(fā)油的總離子流圖，見圖1。經(jīng)GC-MS分析后，共鑒定出33種化合物，用峰面積歸一化法算出其百分含量，所鑒定的化合物占總離子流圖峰面積的81.70%。所鑒定的物質(zhì)主要由萜類(36.65%)、醇類(22.96%)、烷烴類(11.33%)和酯類(10.76%)等化合物組成。其中，(-)-斯巴醇(11.55%)，d-杜松烯(10.72%)、α-杜松醇(8.65%)、石竹烯(7.26%)和蒎烷(6.43%)等化學(xué)成分的相對含量較高，結(jié)果見表1。

圖1 SFE法提取的大別山五針?biāo)舍樔~揮發(fā)油的總離子流圖

化合物Compounds分子式Molecular formula分子量/kuMolecular weight相對含量/%Relative amount烷烴類 Alkanes蒎烷2,6,6-Trimethylbicyclo [3.1.1]heptaneC10H181386.43Naphthalene, 1,2,4a,5,6,8a-Hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-C15H242042.421-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫化萘1-Isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthaleneC15H242041.28(1R,4aR,8aS)-,1,2,4a,5,6,8a-六氫化-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)萘Naphthalene,1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-, (1R,4aR,8aS)-C15H242040.88十二甲基-環(huán)六硅氧烷Cyclohexasiloxane, dodecamethyl-C12H36O6Si64440.32萜烯類 Terpenesd-杜松烯d-CadineneC15H2420410.72石竹烯CaryophylleneC15H242047.262,8-二甲基-1,8-壬二烯1,8-Nonadiene, 2,8-dimethyl- C11H201523.84(+)-表倍半水芹烯 (+)-Epi-bicyclosesquiphellandreneC15H242043.22西松烯1,3,6,10-Cyclotetradecatetraene,3,7,11-trimethyl-14-(1-methylethyl)-C20H322722.45α-衣蘭油烯α-MuuroleneC15H242040.88α-石竹烯α-CaryophylleneC15H242041.67可巴烯Copaene C15H242041.58香樹烯AlloaromadendreneC15H242040.95大根香葉烯D Germacrene DC15H242040.94環(huán)氧白菖油烯Calarene epoxideC15H24O2200.72環(huán)氧異香橙烯Isoaromadendrene epoxideC15H24O2200.69

續(xù)表1(Continued Table 1)

化合物Compounds分子式Molecular formula分子量/kuMolecular weight相對含量/%Relative amount(6E,10E)-7,11,15-三甲基-3-亞甲基-1,6,10,14-十六碳四烯(6E,10E)-7,11,15-Trim-ethyl-3-methylene-1,6,10,14-hexadecatetraeneC20H322720.63去氫白菖烯CalameneneC15H222020.34α-蓽澄茄烯α-CubebeneC15H242040.22B-欖香烯B-ElemenC15H242040.32B-新丁香三環(huán)烯B-Neoclovene C15H242040.22醇類 Alcohols(-)-斯巴醇 (-)-SpathulenolC15H24O22011.55α-杜松醇α-CadinolC15H26O2228.653,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇3,7,11,15-Tetramethyl-2- hexadecen-1-olC20H40O2962.76酯類 Esters丁基香茅酯Citronellyl butyrateC14H26O22263.474-羥基-4-甲基-2-戊酮2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl-C6H12O21162.29油酸乙酯Ethyl oleate C20H38O23101.58棕櫚酸乙酯Hexadecanoic acid, ethyl ester C18H36O22841.20亞油酸乙酯Ethyl linoleate C20H36O23081.03菊酸乙酯Ethyl chrysanthemateC12H20O21960.48鄰苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalateC16H22O42780.38醋酸冰片酯Bornyl acetateC12H20O21960.33

3 討論

萜類化合物是植物的特異氣味組分, 在許多害蟲對寄主的選擇和識別過程中起著關(guān)鍵的作用[9]，可作為信號介導(dǎo)對植食性昆蟲產(chǎn)生防御反應(yīng), 并在植物-害蟲-天敵的三級營養(yǎng)關(guān)系中發(fā)揮作用[8]。樸相勇等[9]和滕坤等[10]用水蒸氣蒸餾法分別從紅松和赤松中提取到了α-蒎烯、β-水芹烯和莰烯等成分。田玉紅等[11]用水蒸氣蒸餾法從拉雅松和細(xì)葉云南松松針中提取到了較高含量的α-蒎烯和β-石竹烯。研究表明, 影響和調(diào)節(jié)松科害蟲取食和產(chǎn)卵行為最為重要的信號物質(zhì)包括萜類化合物中的蒎烯、莰烯和水芹烯等[9]。本文首次報道了大別山五針?biāo)舍樔~揮發(fā)油的主要成分。盡管所提取的揮發(fā)油中也檢測到較高含量的萜類化合物，但未發(fā)現(xiàn)上述幾類重要的信號物質(zhì)。因而，大別山五針?biāo)蓳]發(fā)物對害蟲具體產(chǎn)生了怎樣的影響還需要從昆蟲的電生理及嗅覺反應(yīng)等方面進一步測定。

大別山五針?biāo)舍樔~揮發(fā)油的成分和含量與上述物種有所不同，可能是不同的植物揮發(fā)油存在較大差異[12-13]，也可能是提取方法不同而導(dǎo)致。以往研究多以水蒸氣蒸餾法提取針葉揮發(fā)油，而本文采用了超低溫、萃取效率高的超臨界二氧化碳萃取法提取大別山五針?biāo)舍樔~的揮發(fā)油。

盡管目前在大別山五針?biāo)舍樔~的揮發(fā)油中未發(fā)現(xiàn)重要的植物-害蟲-天敵信號化合物，本研究也檢測到了一些有價值的成分。如d-杜松烯和蒎烷可用于制作香料，石竹烯和斯巴醇具平喘、祛痰功效。因而本研究為后期人工栽培進一步開發(fā)利用針葉資源提供了科學(xué)依據(jù)。

致謝：感謝安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳彥教授在超臨界流體萃取方法中給予的技術(shù)指導(dǎo)。