皮膚組織工程進化與三維組織打印技術的機遇及挑戰(zhàn)

太光平, 吳 克, 蔡敬民

(1. 生物增材制造安徽省教育廳重點實驗室 先進生物制造中心， 合肥 230601; 2. 合肥學院 生物與環(huán)境工程系， 合肥 230601)

組織工程皮膚是創(chuàng)面處理非手術治療的主要手段。本文綜述皮膚組織工程產品的發(fā)展，總結現(xiàn)有工程種子細胞和新型生物打印墨水材料, 重點介紹新型三維組織打印技術及多能干細胞在三維打印皮膚組織工程中的應用。

1 皮膚組織工程產品發(fā)展

19世紀80年代，美國EW Lee博士最先嘗試合成類皮膚替代物[1]。到20世紀50—70年代人們開始探索應用合成聚氨酯及去細胞化組織作為燒傷患者創(chuàng)面的保護屏障[2-3]。而里程碑式的進展是Green在1975年首創(chuàng)的角朊細胞培養(yǎng)方法, 以及自體上皮細胞片培養(yǎng)技術 CEAs(Cultured epithelial autografts)[4]。后期開發(fā)設計的多種新型人工皮膚, 特別是含活細胞人工皮膚，顯示較好的促傷口愈合結果。根據人工皮膚的組成或功能特性,可以分為化學合成類與天然脫細胞支架類人工皮膚、含細胞類與不含活細胞類人工皮膚[5-6]、異體活細胞類和自體活細胞類人工皮膚[7]及臨時性或永久性人工皮膚[7-8]。

早期的商業(yè)類產品主要是化學合成類與天然脫細胞支架類人工皮膚。如Alloderm, Matriderm? 及 Hyalomatrix[6,10]。其中, Matriderm?是一種牛源性非交聯(lián)凍干材料, 用于皮膚傷口的臨時覆蓋。后期研發(fā)的商業(yè)類產品添加有異體新生兒包皮成纖維細胞，如Apligraft、Stratagraft、Dermagraft 等同種異體細胞人造皮膚, 移植后其最終逐漸被排異，而只有添加了自體細胞的人工皮膚如EpiCel、ReCel類人工皮膚[5]其自體成纖維細胞和上皮細胞能夠永久地融合入患者皮膚傷口。圖1顯示21世紀人工皮膚替代產品的發(fā)展及重要歷史節(jié)點。

1.1 無細胞的人工合成皮膚

最早具有代表性的化學合成類人工皮膚為Biobrane，由合成尼龍網和交聯(lián)豬真皮組成。臨床研究表明，Biobrane 優(yōu)于燒傷臨床常規(guī)的磺胺嘧啶銀制劑[10]。其他人源天然脫細胞支架人工皮膚包括Alloderm和Dermamatrix，比動物源性的脫細胞人工皮膚好,其避免了動物(豬)源性病毒感染的風險[11]。這一類人工皮膚中值得一提的是由Burke等在1981年開發(fā)的Integra[12-13]。Integra是由層狀多孔的化學交聯(lián)的牛膠原蛋白和鯊魚硫酸軟骨素組成, 其上層由有機硅層覆蓋。 Integra 處理的傷口在2～3周內顯示良好的血管化。盡管該類皮膚替代品相對便宜，但其組織相容性有限，臨床效果較后期研發(fā)的天然脫細胞支架人工皮膚差。

1.2 含活細胞人工皮膚

通過增加同種異體活細胞(主要為上皮細胞或成纖維細胞)的合成皮膚在燒傷傷口治療中顯示更快上皮化。這類包括添加異體或自體皮膚細胞的皮膚替代品。

1.2.1 異體活細胞人工皮膚

TransCyte[14]是最早開發(fā)的, 添加了新生兒成纖維細胞的Alloderm，含成纖維活細胞分泌沉積的生長因子和細胞外基質成分。TransCyte獲得FDA許可用于燒傷治療。該類皮膚還包括 ICX-Skin (英國), 也添加有新生兒成纖維細胞[15]。而Dermograft使用了可吸收聚乙二醇-聚乳酸共聚物支架及新生兒成纖維細胞，其可保存在-80℃, 當植入傷口后，成纖維細胞開始增殖并分泌多種生長因子, 而聚乙二醇酸支架可在移植后3～4周被機體自然吸收[16]。 Apligraft代表了一種 “復合人工皮膚”, 其主要基于牛 I型膠原及新生兒成纖維細胞和上皮細胞。Apligraft 保質期短， 僅為5天,在1998年也被FDA批準用于慢性靜脈性潰瘍和糖尿病腿部潰瘍的治療[6-7]。

1.2.2 自體活細胞類人工皮膚

Bell 在1981年首創(chuàng)一款基于自體活細胞的人工皮膚PermaDerm，使用了膠原蛋白并添加自體成纖維細胞和上皮細胞[17]。PermaDerm在大鼠模型上移植后9天內可形成基底膜,可覆蓋比原供體面積大66倍的燒傷創(chuàng)面[18]。其他產品還有應用透明質酸基質，聯(lián)合應用自體表皮及成纖維細胞的人工皮膚Orcel，以及簡單地把培養(yǎng)自體上皮細胞附著在石蠟紗布的EpicelTM[19-22]。雖然以上幾大類別的人工皮膚產品都已經有了多種商業(yè)化產品，但臨床效果參差不齊，各個產品功效與臨床實際要求仍然有一定距離。尤其是缺乏多種天然皮膚重要的功能單元及細胞成分： 如汗腺細胞、黑素細胞和朗格漢細胞等, 脂肪組織和神經感受細胞基本不存在。因此, 這些人工合成皮膚產品無法提供溫度控制、免疫調節(jié)和壓力感受功能。另一個限制因素是制造成本較高，如無細胞類人工合成皮膚Alloderm和Integra的市場價格約為每平方厘米15～30 美元，異體成纖維細胞類人工合成皮膚TransCyte和DermaMatrix的銷售價格為每平方厘米30～60美元，而含自體活細胞人工復合皮膚EpicelTM覆蓋每1% 的體表燒傷面積的成本超過13 000美元[5]。臨床和市場迫切需要價格更便宜, 功能更好的促傷口愈合的新型活細胞人工合成皮膚。設計新型皮膚替代品，增加皮膚功能細胞種類(比如血管內皮細胞和毛囊細胞)，添加特定的細胞外基質(III型膠原及透明質酸)，引進新興3D生物打印技術，是高精準打印皮脂腺和毛囊，打印微血管網等皮膚功能單元成分，實現(xiàn)人工制造仿自然復合人工皮膚組織工程產品的必經之路。

2 三維生物打印技術在皮膚組織工程中的應用

基于3D打印技術的再生醫(yī)學及組織工程，已經成為繼人類基因組大規(guī)模測序完成之后，生命科學及健康領域中最活躍的發(fā)展領域之一。3D生物打印以計算機三維模型為圖紙，利用特制生物墨水，裝配種子細胞，最終打印具有活性的人體細胞組織和器官，可在將來大面積填補器官移植的缺口。

經典3D打印機根據打印材料的不同分為化學聚合、光敏聚合、黏合劑黏合；不同的打印技術路線分為擠出式、激光打印和噴墨打印等。3D生物打印目前應用較多的主要有3種：包括噴墨、擠出式和激光輔助細胞打印[24]。每種技術都有自己的優(yōu)點和局限性。圖2比較了主要3D生物打印技術的分辨率及生物墨水材料/細胞微觀尺度。

1)噴墨生物打印技術能夠快速地把含細胞的墨滴精確地打印到設計的位置。其特征是能高速地把活體細胞一層一層地打印，主要優(yōu)勢是可實現(xiàn)高速度, 但是由于噴墨的打印頭不能擠出高黏度材料, 所以不適用于高密度細胞的打印[25]。

2)擠出式生物打印在商用3D生物打印機中得到了廣泛的應用[26-28]。生物墨水材料通過噴嘴擠出。基于擠出的原理異同分為: (a) 氣動式，其中分無閥和有閥； (b) 機械式擠出，包括螺桿驅動式擠出和電磁微閥式擠出，擠出噴頭支持的打印墨水黏度范圍較小。與紫外光照/化學和熱交聯(lián)結合后。擠出式生物打印系統(tǒng)可實現(xiàn)接近5～50 μm的分辨率。其缺點包括擠出式應用的機械應力會損傷細胞，影響細胞活力。在皮膚組織生物打印領域，Lee[29-30]報告了3D打印多層人皮膚成纖維細胞和上皮細胞，使用了由氣體驅動的氣動微型噴嘴式擠出的逐層組裝工藝。Cubo[31]應用擠出式3D生物打印，打印由人原代上皮細胞和原代成纖維細胞構建的復合人工皮膚，移植裸鼠后顯示良好的組織化學結構。

3)激光輔助生物打印(Laser assisted bioprinting；LaBP)技術也已應用于人工皮膚打印。Michael[32]應用膠原做打印墨水，打印包括小鼠成纖維細胞和人源性永生化上皮細胞至Matriderm?脫細胞基質上制備復合人工皮膚，該雜合人工皮膚移植裸鼠后顯示類似皮膚的組織化學結構；Koch 等[33-34]應用激光誘導轉移 (Laser-induced forward transfer， LIFT)技術打印人工皮膚, 增殖和凋亡活性分析表明98%的成纖維細胞和約90%的人間充質干細胞能夠在激光轉移打印步驟中存活?；诩す獯蛴√峁┝藘?yōu)良的高分辨率，但目前打印速度相對緩慢，每小時僅能打印1 cm2皮膚組織。與擠出式生物打印技術相比, 激光輔助打印是非接觸式打印, 不會對細胞產生機械應力導致的細胞損傷及活力下降。此外， 激光輔助打印可以打印高黏性墨水材料，但激光的生物打印機器成本較高。

該領域最新發(fā)展的是原位皮膚打印。Hakimi等[23]開發(fā)了一種手持式3D 生物打印機, 能夠在小鼠和豬傷口模型中直接打印皮膚，細胞能在傷口原位形成皮膚片。

圖1 皮膚組織工程的發(fā)展及關鍵技術進化重要時間點[23]

圖2 主要生物打印技術的分辨率及生物材料細胞微觀尺度比較[2，12]

注：噴墨、激光輔助和擠出式生物打印機制與分辨率進行了比較。掃描電子顯微鏡(a)、(b)、(c)、(d) 的照片版權屬于原作者經授權使用[8，18]

當前三維生物打印人工皮膚還處于技術摸索階段。目前報道的三維生物打印人造皮膚尚未添加皮脂腺、毛囊細胞和微血管網等皮膚功能單元成分。

4)皮膚生物打印需要將不同打印技術的優(yōu)勢結合起來，在滿足高分辨率的同時兼顧高通量的要求。Cadau 等[35-36]報道了一個新的NGB 激光生物打印機，應用了激光打印噴頭和噴墨打印噴頭，該系統(tǒng)實現(xiàn)10 μm 的分辨率。該激光打印頭和噴墨打印頭打印的皮膚模型已經用于化合物的高通量毒理篩選及化妝品成分的功能篩選。Kim等[37]則開發(fā)了一種擠出和噴墨聯(lián)合雙打印頭系統(tǒng)，擠出模塊用于打印成纖維細胞，噴墨模塊用于高速均勻打印上皮細胞。同時采用聚己內酰胺復合的膠原打印墨水，該打印系統(tǒng)打印的人工皮膚移植14 d后能形成良好的表皮層。同時，該雙噴頭系統(tǒng)的使用大大地降低了打印材料墨水的用量，從而降低了皮膚制造成本。

圖 3 現(xiàn)有3D打印人工皮膚細胞類型及潛在可應用的功能性細胞類型[31]

注：a為3D打印人工皮膚的組織學使用了a′原代成纖維細胞和原代人上皮細胞; b′為潛在的可用于皮膚打印的種子細胞; b為皮膚細胞模型圖。Epp (Epithelia) De (dermis) 標尺: 100 μm

3 皮膚組織應用材料及技術

3.1 皮膚生物打印墨水材料

生物打印墨水制約著3D 打印分辨率和生物打印構建組織質量。生物打印墨水材料為種子細胞提供物理和生化微環(huán)境信號，可影響細胞極性, 控制細胞遷移。

脫細胞外基質dECM (decelullar extracellular matrix)含有豐富的細胞生長分化信號, 有利于組織再生修復，基于脫細胞外基質的墨水缺點是機械性能差, 該特性可通過添加聚己內酰胺進行優(yōu)化，已用于生物3D打印[38]。

其他潛在的皮膚生物打印墨水材料包括最近開發(fā)的具有高導電性的多聚糖生物打印材料，可利用其導電特性對培養(yǎng)的細胞或組織實施電刺激，用以促進干細胞分化和傷口愈合[39]。其他材料包括特種相轉換水凝膠[40]和產氧水凝膠[41]已經用作生物打印材料，其可對打印組織結構的細胞微環(huán)境實現(xiàn)操控。而其它已廣泛應用于傳統(tǒng)組織工程的生物相容性材料，如低熔點瓊脂糖、Pluronic? F-127、殼聚糖、溫敏性、熱敏性、pH值敏感性水凝膠等，可單獨應用或者混用可開發(fā)為潛在的皮膚生物打印墨水材料[42]。

3.2 皮膚組織工程種子細胞的選擇

原代自體成纖維細胞、永生化成纖維細胞系已在傳統(tǒng)皮膚組織工程中得到了廣泛的應用。但原代自體細胞來源受限，永生化成纖維細胞系其臨床價值有限。比如已報道的激光及擠壓式皮膚三維生物打印實驗中, 使用了小鼠 NIH3T3 成纖維細胞和人源性永生化HaCat上皮細胞，其主要用于3D打印系統(tǒng)功能的驗證，無臨床應用價值。因此開發(fā)選擇適合3D打印并有臨床價值的種子細胞仍然需要進一步探索。

3.2.1 應用淺表新生兒成纖維細胞減少瘢痕的形成

成纖維細胞是真皮層的主要成分, 具有合成膠原、分泌生長因子、啟動傷口愈合的功能。真皮區(qū)域可進一步分為上層真皮和下層網狀真皮。已發(fā)現(xiàn)上層真皮與下層真皮中成纖維細胞有異質性[43-44]。在培養(yǎng)的人工皮膚中加入上層真皮成纖維細胞后顯示瘢痕形成減少。上層真皮顯示高III 型/I 型膠原比例, 下層真皮顯示低III型/I 型膠原比例。此外，有證據提示，選擇性使用新生兒淺層真皮成纖維細胞可能有利于皮膚再生并且減少瘢痕的形成。同時，同種異體新生兒上皮細胞由于其人類白細胞抗原分化程度低，從而可減少移植后的免疫排斥反應性[45-46]。另一個有趣的現(xiàn)象是，口腔黏膜傷口的愈合是已知的唯一成人無疤痕愈合典型。盡管人口腔或傷口處始終存在一定程度的微生物，該無疤痕愈合機制目前仍然不清楚[47]。同時文獻顯示基于口腔上皮細胞及成纖維細胞的人工皮膚組織顯示良好的基底膜形成及上皮細胞分化，其中其創(chuàng)面高水平的透明質酸水平與高水平III型膠原是否與創(chuàng)面無瘢痕愈合有關仍需研究[48]。

3.2.2 干細胞來源的種子細胞用于皮膚生物打印

傳統(tǒng)的組織工程皮膚只提供了最基本的兩類細胞(上皮細胞及成纖維細胞)。由于技術限制，難以添加更復雜的皮膚附屬器官細胞，如皮膚色素細胞和血管網內皮細胞。而隨著干細胞技術的進步,比如可利用干細胞或iPSCs (induced pluripotent stem cells)分化獲取上述功能細胞以促進創(chuàng)面愈合，使恢復微血管形成成為可能。

脂肪源性干細胞ADSCs(Adipocyte-derived stem cells)能夠分泌血管生成因子，可增加微血管形成。Trottier等[49]采用傳統(tǒng)的3層皮膚模型, 證明ADSCs可替代成纖維細胞重建人工皮膚， ADSCs培養(yǎng)基可刺激皮膚成纖維細胞膠原合成和細胞遷移, 分泌血管內皮生長因子, 從而加速傷口愈合。

羊水源性干細胞AFS(Amniotic fluid-derived stem cells) 也可作為成纖維細胞的替代細胞。 Skardal等[50]發(fā)現(xiàn)與MSC治療的傷口相比, AFS細胞治療傷口的微血管密度和毛細血管直徑有明顯增加。AFS容易分離，染色體穩(wěn)定, 同時AFS細胞不會誘發(fā)免疫排斥,是一種潛在的人工皮膚種子細胞。

另一類潛在種子細胞為誘導性多能干細胞(iPSCs)，iPSCs的應用克服了傳統(tǒng)組織工程中細胞數量這一瓶頸，使得體外提供無限制細胞數量成為可能。皮膚成纖維細胞可重新編程逆向分化成為 iPSCs干細胞[51]。而iPSCs可以再重新分化為角質細胞和成纖維細胞[52]、汗腺細胞[53]及其他任何相關功能細胞用于重建人工皮膚[54-55]。

4 三維生物打印網絡化血管人工組織

構建組織工程血管樣網絡以確保營養(yǎng)供應，促進打印組織與宿主融合仍然為組織工程領域的主要難題。De等[56]報道構建基于內皮細胞的血管化微球體可以為血管化三維組織工程提供新策略。應用成纖維細胞及脂肪組織衍生的間充質干細胞ADSC作為支持細胞，內皮細胞可在微球體內自發(fā)形成毛細血管樣網絡。Hendrickx[57]則用一種定制的水凝膠促進組織工程結構毛細血管網絡的形成。Hreimendahl[58]報道了應用犧牲材料的方法打印設計的血管網絡。

5 生物打印組織工程產品標準

生物打印技術與干細胞分化技術的結合使打印高度仿真人造皮膚成為可能。尚有許多臨床前試驗及臨床批文需要完成，所有成分組件包括細胞、生物墨水和生物打印機系統(tǒng)都必須滿足安全、無菌、質控方面的要求和監(jiān)管。工藝必須納入(Good manufacturing practice)規(guī)范管理, 生物打印機軟硬件及系統(tǒng)所有組件必需是臨床級而非目前實驗室級別[59-60]。最近, 美國測試與材料學會ASTM (American society for testing and materials) 發(fā)布了材料添加劑制造標準[61]。美國食品和藥物管理局FDA發(fā)表了關于三維打印的指導原則，對醫(yī)療設備和產品使用添加成分提出要求。同時, ASTM國際委員會、國際標準化組織技術委員會和英國標準研究所也出臺了組織工程產品要求標準[62]。中國食品藥品監(jiān)督管理局尚無關于三維打印產品的規(guī)范性文件。目前執(zhí)行的仍然是國食藥監(jiān)械[2007]76號國家《組織工程醫(yī)療產品研究及申報相關要求》。其對組織工程產品中的生物技術部分(包括活細胞、生物活性成分等)參照《藥品注冊管理辦法》，對生物制品的相關要求目前還包括不低于300例的包含Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期臨床試驗等[63]。

6 存在的問題及展望

目前在開發(fā)皮膚替代品和新興技術方面，盡管傳統(tǒng)工藝皮膚組織工程進步很大, 但當前組織工程皮膚仍有問題待解決，如血管化和必要的皮膚附屬器和色素沉著等難題。隨著高精度的3D 生物打印技術的成熟, 更多的新型細胞或干細胞分化皮膚附件細胞可用于皮膚3D生物打印；創(chuàng)新材料比如具有導電特性的生物打印材料，可支持快速血管化, 并促進創(chuàng)面皮膚愈合。