七氟醚預(yù)處理對高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

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近年來，糖尿病的發(fā)病率逐年增高，血管并發(fā)癥是糖尿病致死致殘的主要原因。而血管內(nèi)皮功能損傷是糖尿病血管病變發(fā)生的始動因素和主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，甚至在尚未出現(xiàn)慢性血管并發(fā)癥的糖尿病病人已出現(xiàn)內(nèi)皮功能明顯降低。高血糖可以通過多種機制損傷血管內(nèi)皮細胞功能，如氧化應(yīng)激、炎癥、蛋白質(zhì)非酶糖基化、繼發(fā)性脂代謝紊亂等[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)新型麻醉藥七氟醚有心血管保護作用。本研究對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECS)進行高濃度葡萄糖處理，模擬糖尿病體內(nèi)環(huán)境，通過檢測細胞凋亡率觀察內(nèi)皮細胞的損傷情況及七氟醚對受損內(nèi)皮細胞的保護作用，并從細胞增殖、凋亡與抗凋亡以及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達改變及超氧化物歧化酶(SOD)抗氧化等多個角度探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 細胞培養(yǎng)試劑均購自Gibco公司，人臍靜脈內(nèi)皮細胞由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院提供，七氟醚免疫細胞化學(xué)試劑盒購自博士德公司。

1.2 原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞鑒定 人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細胞密度達到70%左右時在倒置顯微鏡下攝片觀察細胞形態(tài)，用兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原(Ⅷ因子RAg)多克隆抗體進行。

1.3 實驗分組 人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長至70%～80%融合時，分為4組：正常糖濃度組(A組，5.5 mmol/L葡萄糖)、高葡萄糖組(B組，25 mmol/L葡萄糖)、甘露醇組(C組，5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高葡萄糖(25 mmol/L葡萄糖)+七氟醚組(D組)。處理72 h后用于后續(xù)實驗。

1.4 MTT法檢測各組細胞的存活率 以每孔100 μL(細胞數(shù)1×104)將細胞接種于 96孔板，每組12復(fù)孔。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加0.1 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和10 μL MTT溶液，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)4～6 h，每孔加0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)，酶聯(lián)檢測儀測定A570。實驗重復(fù)3次。根據(jù)以下公式計算各實驗組的存活率：存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)

1.5 流式細胞術(shù)碘化丙啶(PI)/Annexin雙染法檢測細胞凋亡 各組細胞胰蛋白酶消化后離心，棄上清，加入200 μL Binding Buffer并重懸細胞，然后加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.6 RT-PCR測定細胞中eNOS mRNA的表達 取各組細胞5×106，Trizol一步法分別提取細胞總RNA，取2 μg總RNA用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴增eNOS，設(shè)計eNOS基因特異引物為F:5′-CTCATGGGCACGGTGATG-3′；R:5′-ACCACGTCAACTCCCATACAC-3′；擴增DNA片段為152 bp，同時擴增人GAPDH作為內(nèi)參照，GAPDH的基因特異引物為F:5′-AACAGCGACACCATCCTC-3′；R: 5′-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA-3′，擴增DNA片段為85 bp；循環(huán)條件:預(yù)變性 95 ℃2 min，變性94 ℃1 min，退火55 ℃2 min，延伸72 ℃90 s，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照。BIO RAD Molecular Imager Gel Doc XR 170-8171型紫外凝膠圖像成像分析系統(tǒng)成像，應(yīng)用Quantity One軟件進行積分吸光度測定及半定量分析，目的基因mRNA 的相對表達水平用IA/ IAβ - actin值來表示。

1.7 ELIAS檢測SOD含量 取細胞各5×104接種于12孔板，每24 h收集培養(yǎng)上清(-70 ℃凍存)，更換新鮮培養(yǎng)液，連續(xù)7 d，用SOD SELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清SOD中的活性。具體過程操作步驟按試劑盒說明書進行，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD 活力。

1.8 蛋白免疫印跡 各組細胞分別提取蛋白，BCA定量分別得出樣品蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，調(diào)整蛋白上樣濃度一致，100 V，2 h電泳，隨后按照1.5 A/cm2選擇恒流轉(zhuǎn)膜1.5～2.0 h。將聚偏二氟乙烯膜(PVDF)浸泡在含5%脫脂奶粉的TBST中，室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，隔天按照說明書比例室溫孵育二抗1～2 h，隨后用凝膠成像儀進行發(fā)光并記錄灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下形態(tài)學(xué)觀察 B組、C組、D組處理72 h后細胞形態(tài)均發(fā)生不同程度變化，長軸變長，呈梭形者增多。詳見圖1。

圖1 各組內(nèi)皮細胞光鏡下形態(tài)(×400)

2.2 細胞存活率檢測 B組內(nèi)皮細胞存活率顯著低于A組(P<0.05)，D組細胞存活率較B組顯著增加(P<0.01)，C組與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 A組：常規(guī)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞早期凋亡率為5.54%，晚期凋亡率為11.01%，細胞死亡率為16.55%。B組：早期凋亡率為6.16%，晚期凋亡率為15.06%，細胞死亡率為21.26%。C組早期凋亡率為12.02%，晚期凋亡率為24.83%，細胞死亡率為36.85%。D組：早期凋亡率為10.68%，晚期凋亡率為36.18%，細胞死亡率為46.86%。B組和D組細胞凋亡率較與A組均有所增加(P<0.05)。詳見圖3。

2.4 RT-PCR測定細胞中eNOS mRNA的表達 灰度分析表明，B組高葡萄糖濃度處理72 h后eNOSmRNA表達量明顯降低，與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；D組eNOSmRNA表達量高于B組(P<0.05)。詳見圖4。

2.5 SOD活性檢測 A組、B組、C組、D組細胞的SOD活性分別為(223.95±4.67) U/mgprot、(229.67±4.56)U/mgprot、(147.12±2.64)U/mgprot、(183.97±4.67)U/mgprot。與B組比較，C組SOD活性明顯降低(P<0.05)，七氟醚處理后SOD有回升趨勢(P<0.05)。詳見圖5。

2.6 Western Blot結(jié)果 與A組相比，B組、C組、D組細胞蛋白表達Bax明顯增高，D組是A組的1.3倍，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，B組是A組的1.5倍，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。D組Bcl-2的表達量較其他組明顯降低，是A組的1.8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖6。

3 討 論

在糖尿病病理進程中，血管內(nèi)皮細胞是高血糖首先破壞的靶點。研究表明，糖尿病病人的血管生理機能、亞細胞結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)、細胞分子和分子生物學(xué)方面的異常都與高血糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)。高血糖導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷與凋亡，內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，血管內(nèi)皮完整性和血管功能遭到破壞，從而直接引起血管病變的發(fā)生。

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.01

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

與B組比較，*P<0.01

本研究證實高葡萄糖濃度處理使內(nèi)皮細胞基因bax轉(zhuǎn)錄水平提高，使內(nèi)皮細胞受損傷后盡早啟動凋亡機制，從而引發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡。抑制基因bcl-2轉(zhuǎn)錄水平表達及蛋白表達，使內(nèi)皮細胞受損傷后抗凋亡能力降低，而易發(fā)生損傷后凋亡。而七氟醚通過抑制bax表達，增加bcl-2表達起到抗凋亡作用，保護內(nèi)皮細胞。這與高糖可導(dǎo)致氧化應(yīng)激暴發(fā)、惡化線粒體功能紊亂并改變膜的特性，線粒體外膜的損傷伴隨著 Bcl-2 蛋白激活導(dǎo)致線粒體外膜通透性改變、釋放細胞色素 C、Caspase 活化和細胞凋亡的報道相一致[2]。高糖可造成細胞內(nèi)氧化應(yīng)激增加，過多的氧自由基可以激活p21(ras)-MAPK-NFkB通路，使NF-κB入核，然后造成細胞內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥因子的表達，促使白細胞穿越和黏附在血管內(nèi)皮細胞上，造成血管壁的炎癥反應(yīng)；還可以通過P38MAPK途徑抑制NO的生成，使血管的舒張功能受到影響。有研究觀察了高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)在細胞培養(yǎng)基中加入含有糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的胎牛血清，然后培養(yǎng)6～48 h可使人臍靜脈內(nèi)皮細胞明顯凋亡。

源自糖尿病病人靜脈內(nèi)皮細胞中線粒體動力學(xué)發(fā)生改變，與健康對照相比，糖尿病病人靜脈內(nèi)皮細胞 Fis1 表達增加，線粒體碎片增多；當培養(yǎng)的人主動脈內(nèi)皮細胞暴露于 30 mmol 的葡萄糖時也發(fā)現(xiàn)類似改變，線粒體網(wǎng)絡(luò)減少，F(xiàn)is1 和 Drp1 表達增加。線粒體動力學(xué)的改變與線粒體活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生增加、激活內(nèi)eNOS與環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的顯著受損相關(guān)；使用 siRNA 沉默 Fis1 和 Drp1，減少了高糖誘導(dǎo)的線粒體網(wǎng)絡(luò)改變、ROS 產(chǎn)生、eNOS活化與 cGMP產(chǎn)生。

圖6 Western Blot結(jié)果

以上結(jié)論表明，線粒體分裂增加參與了糖尿病內(nèi)皮細胞功能障礙的發(fā)生與發(fā)展。而高糖可導(dǎo)致細胞的氧化應(yīng)激，細胞中自由基的特異性清除酶如SOD及過氧化氫酶(POD)是保護機體免受損傷的關(guān)鍵酶，本實驗研究表明，七氟醚可提高內(nèi)皮細胞SOD活性，可能通過SOD的活性增高起到抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，進而保護生物膜的作用。

血管內(nèi)皮細胞的功能紊亂與內(nèi)皮細胞的凋亡是糖尿病血管并發(fā)癥的重要發(fā)病原因，生理條件下 PI3K-AKt 通路與內(nèi)皮功能活性密切相關(guān)：PI3K-AKt 通路可通過磷酸化 Akt 的 Thr308 和 Ser473 兩個位點促進內(nèi)皮細胞增殖，通過抑制caspase-9 減少內(nèi)皮細胞凋亡，還可以磷酸化 eNOS 的 Ser1177 位點來促進NO生成[3]。本實驗證實外源性地給予七氟醚處理可以增強pAkt的表達，提示可通過促進PI3K/Akt途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的功能活動。

七氟醚作為繼乙醚、氟烷之后的第三代麻醉吸入藥，有著復(fù)雜的藥理學(xué)效應(yīng)和病理生理機制，比如：七氟醚自身是促進炎癥還是抑制炎癥；是促凋亡還是抗凋亡；以及是否能改善術(shù)后細胞損傷，尤其是圍術(shù)期的副作用都有待進一步實驗研究。