復合木霉菌制劑防治草莓苗枯萎病的研究

干華磊，王承芳，郝文娟，葉乃瑋，毛偉力

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復合木霉菌制劑防治草莓苗枯萎病的研究

干華磊，王承芳，郝文娟，葉乃瑋，毛偉力*

（上海萬力華生物科技有限公司，上海 200000）

將木霉（spp.）菌株Tr14、Tr25、Tr85分別制成含2×108g-1孢子的單菌株、雙菌株（Tr14+Tr25；Tr14+Tr85；Tr25+Tr85）或三菌株（Tr14+Tr25+Tr85，TM3）復合可濕性粉劑（WP），用于防治草莓枯萎?。╢. sp. fra-gariae）的室內藥效生測試驗。結果表明：經(jīng)TM3 WP 200倍，30%精甲·噁霉靈WP 1 500倍以及Tr14+Tr85雙菌株復合WP處理的草莓苗，在發(fā)病率（，%）和防治效果（，%）上，無顯著差異，但它們（/）都顯著地低于（≤0.05）或高于（≤0.05）經(jīng)單菌株200倍、其他雙菌株復合WP 200倍、以及空白對照處理的草莓苗。繼續(xù)將TM3 WP分別用于2016、2017年上海、北京、福建和重慶的兩年四地的田間藥效試驗。結果顯示，經(jīng)TM3 WP 100、200倍、以及30%精甲·噁霉靈1 500倍處理的草莓苗，其兩年四地的值和值，都顯著地低于（≤0.05）或高于（≤0.05）經(jīng)TM3 WP 400倍、枯草芽孢桿菌1 000倍、以及空白對照處理的草莓苗。

木霉菌；草莓枯萎病；生物防治；防治效果

草莓（Duch）屬薔薇科、草莓屬、多年生草本植物。其果實柔軟多汁、可口、營養(yǎng)豐富而備受歡迎，并具有重要的經(jīng)濟地位[1-3]。隨著設施栽培面積的不斷擴大，由尖孢鐮刀菌草莓?；停╢. sp. fra-gariae）[4]引起的草莓枯萎病在我國主要的草莓種植區(qū)普遍發(fā)生，危害程度逐年加重[5]。當連作種植時，草莓枯萎病的發(fā)病率可高達89.2%[6]。病原菌可通過農具、種苗、土壤灌溉水等方式傳播，也可以通過病殘體，在草莓分苗或移栽時傳播蔓延。病原菌從根部傷口侵入，在根和莖的維管束內繁殖并分泌毒素，破壞植株疏導機能和正常生長。該病害可從苗期或開花期一直延續(xù)至收獲期。植株一旦發(fā)病將導致結實率降低、果實膨大異常、品質下降[7]。

目前用于防治草莓枯萎病的方法主要包括：農業(yè)防治、物理防治、化學防治和生物防治。農業(yè)防治主要采用輪作、種苗移栽前脫毒、選育抗病品種以及高架基質栽培等技術，但這些技術提高了勞動強度和生產(chǎn)成本，未能在草莓種植中得到廣泛應用[8]。物理防治主要采用高溫土壤滅菌，但該方法存在勞動強度大和滅菌不徹底的問題[8]。目前防控草莓枯萎病主要采用化學防治，常用藥包括百菌清、代森錳鋅、特克多、多菌靈和甲基托布津等殺菌劑。但是，長期使用這些藥劑會導致病原菌對這些藥劑產(chǎn)生抗藥性，使防治效果逐年降低，同時也使草莓產(chǎn)量、生態(tài)環(huán)境和食品安全都受到威脅[1]。因此，開發(fā)能有效防治草莓枯萎病的新藥，并能減少化學殘留、提高食品安全，是整個草莓產(chǎn)業(yè)的當務之急?？蒲腥藛T已采用了許多有拮抗功能的生防菌來防控植物病害。目前常用的生防菌主要有：①木霉菌（spp.）；②芽抱桿菌屬細菌（spp.）；③假單胞菌屬細菌(spp.)等[9]。Ji M X等[10]利用枯草芽孢桿菌DJ-6與吡唑醚菌酯的混配藥劑，對草莓枯萎病原菌有顯著的抑菌活性，其田間防效能夠達到93.11%。陳宏州等[11]利用NF0919菌株發(fā)酵液和申嗪霉素對草莓枯萎病進行藥效測試，防效分別達到65%和90%。本研究將相容性好，對草莓枯萎病原菌有拮抗功能的木霉菌株，分別制成單菌株、雙菌株和三菌株復合WP，對草莓枯萎病進行了室內和兩年四地的大田藥效試驗，為生物農藥防控草莓枯萎病提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 木霉菌（spp.）：菌株Tr14、Tr25、Tr85、Tr121、T266由上海萬力華生物科技有限公司（上海萬力華）提供。

病原菌：尖孢鐮刀菌(f. sp，F(xiàn)U-1) 由上海萬力華提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA，土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL）； 馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB，土豆200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL）。

1.1.3 草莓苗和試驗基地 室內生測：草莓苗（紅頰）和試驗基地都由上海市青浦區(qū)白鶴草莓研究所提供；大田測試：上海浦東新場小王草莓園、北京綠水峽谷果蔬合作社、福建省寧德市七都鎮(zhèn)關庴村、重慶北碚區(qū)東陽鎮(zhèn)。

1.1.4 供試藥劑 30%精甲·噁霉靈，由四川國光農化股份有限公司提供；Tr14、Tr25、Tr85單菌株、雙菌株、三菌株復合WP，由上海萬力華提供；1 000億/g枯草芽孢桿菌，由武漢天惠生物工程有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉菌相容性測試 將供試的5株木霉菌菌株，隨機取3株菌株為一組，用打孔器（直徑5 mm）取各菌株平板上菌落邊緣的菌塊，將其均勻接種于距平皿邊緣2 cm的圓周上，每個處理重復3次。將平皿放置在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，觀察和記錄目標木霉菌株與其它木霉菌株之間的相容性反應。2個菌株生長之間不產(chǎn)生抑菌條帶（抑菌圈）的為相容性好，反之為不相容。

1.2.2 室內生測篩選實驗 （1）病原菌接種體培養(yǎng)。將草莓枯萎病菌（FU-1）接種于 PDA平皿上，在25 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)5 d，然后轉接到裝有200 mL高溫滅過菌（121 ℃）的PDB培養(yǎng)液的中，放置于25 ℃搖床上以120 r/min培養(yǎng)5 d；用四層無菌紗布過濾收集病原菌的孢子液，并用無菌水將孢子液配制成孢子濃度為1.0×107個/mL，置于4 ℃冰箱中備用。將壤質菜園土與有機栽培基質(由山東商道生物科技有限公司提供)按1﹕1混勻后，然后裝入直徑為9 cm的塑料盆缽內備用。

（2）室內生測實驗。室內盆栽試驗于2016年8月10日在上海市青浦區(qū)白鶴草莓研究所溫室大棚進行。先用無菌水沖洗紅頰草莓苗根部的土壤，并剪掉部分側根；然后將草莓苗浸蘸到1.0×107個/mL的FU-1孢子液中20 min；最后將草莓苗移栽到上述塑料盆缽內；以浸蘸無菌水為對照。將草莓苗移栽好后，分別用100 mL Tr14、Tr25、Tr85木霉菌各菌株的WP200倍液、3個菌株兩兩混合的WP200倍液、3個菌株混合的WP200倍液、30%精甲·噁霉靈1 500倍液對草莓苗進行灌根處理，每隔7 d灌根一次，共處理3次，以無菌水灌根為對照。每個處理供試20盆草莓苗，在藥劑處理后對草莓苗進行常規(guī)水肥管理。

最后一次處理后30 d，調查各處理草莓枯萎病的發(fā)病情況，并計算防治效果。發(fā)病率和防治效果的計算公式為：

發(fā)病率=處理發(fā)病植株數(shù)/處理總株數(shù)×100% ①

防治效果=(對照發(fā)病率－處理發(fā)病率)/對照發(fā)病率×100% ②

1.2.3 大田藥效試驗 本次田間藥效試驗分別在2016年、2017年，上海浦東新場小王草莓園、北京綠水峽谷果蔬合作社、福建省寧德市七都鎮(zhèn)關庴村、重慶北碚區(qū)東陽鎮(zhèn)完成了試驗；實驗共設6個處理：TM-3 WP100倍、TM-3 WP200倍、TM-3 WP400倍、30%精甲·噁霉靈1 500倍、枯草芽孢桿菌1 000倍、空白對照。每個處理3次重復，每個重復有500株苗, 隨機排列。試驗分別于2016年10月8日和2017年10月10日，采用灌根方式進行用藥，每株苗灌根100 mL，每隔7 d灌根一次，共處理3次。

調查時間和方法：于第3次藥后7~14 d統(tǒng)計發(fā)病率，并計算防效；小區(qū)所有植株全部調查，調查各處理的病苗數(shù)，計算病苗率和防治效果；發(fā)病率和防治效果同1.2.2室內生測的計算方法，試驗數(shù)據(jù)用鄧肯新復極差法進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 相容性測試結果

5個對FU-1生長抑制率強的木霉菌株Tr14、Tr25、Tr85、Tr775、Tr266，以Tr14作為目標菌株，測試Tr14與其它4個菌株之間的相容性。結果（表1和圖1）顯示，Tr14分別與Tr25和Tr85菌株相容性好，Tr25與Tr85相容性好，但Tr14與Tr775和Tr266不相容。

表1 木霉菌相容性測試結果

“＋”表示菌株之間相容性好，“-”表示菌株之間不相容

2.2 室內生測試驗

根據(jù)相容性測試的結果，選擇Tr14、Tr25、Tr85 3個菌株的單菌株、雙菌株及3個菌株的混合WP以及化學農藥30%精甲·噁霉靈進行室內生測試驗。結果（表2）顯示Tr14、Tr25、Tr85 3個菌株兩兩混合的WP處理，其枯萎病的發(fā)病率都在20%以下，而單菌株WP處理的發(fā)病率則都在25%以上；而3個菌株混合的WP處理其發(fā)病率則為9.8%，防效為83.2%，發(fā)病率明顯低于而防效明顯高于其他處理。

A：Tr14，B：Tr25，C：Tr85

2.3 田間藥效實驗

將Tr14、Tr25、Tr85 3個菌株的復合WP應用于兩年四地的防治草莓枯萎病的田間藥效試驗，結果（表3）顯示，在2016、2017兩年四地的田間藥效試驗中，兩年的實驗數(shù)據(jù)基本一致。復合菌劑TM3 WP稀釋100倍、200倍的處理的防效顯著的高于稀釋400倍的防效，而TM3-100和TM3-200處理之間兩年的實驗結果，兩者都沒有顯著性差異，防效都達到了66.67%~87.23%。另外，復合菌劑TM3-100和TM3-200處理，與兩個對照藥劑的防效相比，都顯著（≤0.05）的高于或者無顯著差異，兩個對照藥劑的防效為58.6%~88.83%。

表2 復合木霉菌WP防治草莓枯萎病室內生測試驗結果

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（≤0.05，Ducan氏新復極差法）

對比兩年的數(shù)據(jù)中還可以看出，同一地區(qū)兩年的病情指數(shù)有一些差異，同時不同地區(qū)相同的年份間病情指數(shù)同樣也有差異。這主要與不同年份不同地區(qū)間的的天氣情況有關。因為草莓枯萎病的發(fā)生與土壤濕度以及定植后的溫度有比較大的關系。比如上海在2016年的草莓定植期間雨水較多，而2017年則相對少一些，所以2017年的病情指數(shù)要比2016年的低；而北京與上海相比，屬于比較干燥的地區(qū)，雨水也相對較少，所以兩年的病情指數(shù)相對上海以及其他地區(qū)的病情指數(shù)都要低。

表3 木霉菌復合菌劑防治草莓枯萎病田間藥效實驗結果

表中各數(shù)值是每個處理3個重復的平均值，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（≤0.05，Ducan氏新復極差法）

3 討 論

草莓枯萎病是近幾年草莓生產(chǎn)上遇到的較難防治的土傳病害，尤其是在多年種植草莓的重茬地塊，嚴重時可造成整個草莓區(qū)的毀園[12]。從目前對草莓枯萎病等病害的防治措施來看，種植戶仍以化學藥劑為主，生物農藥為輔，應用化學藥劑防治植物病害，雖能快速有效地達到防治目的，但長期單一使用，病原菌會產(chǎn)生抗藥性[13]。所以當前，利用生物農藥防治土傳病是解決草莓連作障礙技術研究的熱點。國內外也有很多研究報道利用微生物防治草莓土傳病害。馮玉龍等[14]進行了利用拮抗芽孢桿菌發(fā)酵液的硫酸銨沉淀物防治草莓黃萎病的研究。徐淑華等[15]利用兩株拮抗細菌和多種植物提取物防治草莓黃萎病，取得了初步成效。Porras等[16]對太陽能土壤消毒和木霉菌劑相結合的方法進行了試驗研究，得出采用在太陽高溫消毒后再添加生物菌劑的方法，兩年防效可達84.5%。本研究通過拮抗篩選出的3個木霉菌復合菌劑WP經(jīng)過兩年四地的田效試驗，兩年的防效都能達到75%以上，試驗效果穩(wěn)定，與近年來的研究觀點一致。

由于單一生防菌株適應性有一定限制，使用復合菌則可拓寬木霉菌的適應范圍，有利于抵抗葉表和土壤不良的環(huán)境條件，同時強化生防效應，因為混合使用時菌株間的作用可能不只是簡單的積加而具有了一定的協(xié)同性，提高了與病菌的競爭能力[17]。宋志偉等[18]用復合微生物制劑防治草莓黃萎病，田間防效達76.9%～84.6%。Vosatka等[19]用AMF()和同時接種草莓根際土壤，具有增效互作作用。本研究中室內篩選時兩個菌株混合的WP處理，對草莓枯萎病的防效能夠達到66.9%~77.2%，單菌株的防效只有53.9%~57.1%，而3個菌株混合的WP處理其防效可以達到83.2%，明顯的高于單菌株和雙菌株的處理。

另外，本研究在選擇菌株混配的時候，前期進行了菌株與菌株間的親和性測試，因為菌株之間的親和與否對植物病害的防治效果有一定的影響。如菌株之間親和性好，通常有協(xié)同增效作用，如菌株之間親和性不好，容易引起藥效不穩(wěn)定[20]。陳志誼[21]研究了拮抗細菌菌株之間親和性和生物防治效果之間的關系，結果顯示菌株之間親和性越好，其對病原菌的防治效果越佳。因此在生物防治的實際應用中，對不同的菌株進行親和性測試，篩選出具有協(xié)同、增效作用的親和性好的菌株，作為生防菌組合菌劑，具備使其較好的防治效果和生態(tài)適應性。

[1] 楊煥青, 王開運, 范昆, 等. 草莓枯萎病菌的生物學特性及７種殺菌劑對其抑制作用[J]. 植物保護學報, 2008, 35(2): 169-174.

[2] 郝保春. 草莓生產(chǎn)技術大全[M]. 北京: 中國農業(yè)出版社, 2001.

[3] 馬寶紅, 甄文超, 曹克強, 等. VAM真菌對草莓促生、防草莓黃萎病效應初探[J]. 河北農業(yè)大學學報, 2004, 7(4): 71-73.

[4] 劉躍庭, 羅加鳳, 宋旭, 等. 檢疫性真菌草莓枯萎病菌概述[J]. 植物檢疫, 2013, 27(6): 72-75.

[5] Suga H, Hirayama Y, Morishima M, et al. Development of PCR primers to identifyf. sp.[J]. Plant Disease, 2013, 97(5): 619-625.

[6] 吉沐祥, 楊敬輝, 吳祥, 等. 大棚草莓主要病害發(fā)生規(guī)律與綠色防控措施[J]. 江蘇農業(yè)科學, 2012, 40(10): 114-117

[7] Koike S T, Kirkpatrick S C, Groden T R. Fusarium wilt of strawberry caused byin California[J]. Plant Disease, 2009, 93(10): 1077-1077.

[8] 糜林, 楊金輝, 霍恒志, 等. 土壤高溫還原消毒法克服草莓黃萎病試驗[J]. 江蘇農業(yè)科學, 2010, 38(5): 179-180.

[9] 賀字典, 高玉峰. 生防菌在植物病害防治中的研究進展[J]. 河北科技師范學院學報, 2003, 17(2): 56-59.

[10] Ji M X, Yao K B, Li G P, et al. Control effects of bacillus subtilis DJ-6 and pyraclostrobin alone and in combination against[J]. Agricultural Science & Technology, 2014.

[11] 陳宏州, 莊義慶, 楊敬輝. 黃麻鏈霉菌 NF0919菌株對草莓枯萎病的生防活性初探[J]. 江西農業(yè)學報, 2014(11): 54-57.

[12] 伊海靜, 陳艷等. 草莓枯萎病菌的分離鑒定及防治藥劑篩選[J]. 西北農業(yè)學報, 2016, 25(4): 626-635.

[13] 楊煒華, 劉開啟. 蘋果輪紋病菌對多菌靈、甲基硫菌靈的抗藥性測定[J]. 植物保護學報, 2002, 29(2): 191．

[14] 馮玉龍, 陽麗, 王銀定, 等. 草莓病害生物防治初探[J]. 河北農業(yè)大學學報, 1999, 22(3): 59-61．

[15] 徐淑華, 蔣繼志, 姚克文, 等. 兩株拮抗細菌對草莓根腐病的抑制作用[J]. 河北農業(yè)大學學報, 2005, 28(3): 81-83．

[16] Porras M, Barrau C, Romero F. Effects of soil solarization and Trichoderma on strawberry production[J]. Crop Protection, 2007, 26: 782-787．

[17] Mao W L, Lunsden R D, Lewis J A, et al Seed treatment using pre-infiltration and biocontrol agents to reduce damping-off of corncaused by species of Pythium and Fusarium[J]. Plant Disease, 1998, 82: 294-299.

[18] 宋志偉, 陳世昌, 王小琳, 等. 復合微生物制劑對重茬草莓生長及產(chǎn)量品質的影響研究[J]. 土壤通報, 2006, 37(3): 560-562．

[19] Vosatka M, Gryndler M, Prikryl Z, et al. Effect of rhizosphere bacterium,fungi and substrate composition on the growth of strawberry[J]. Agronomie, 1992(12): 859-863．

[20] 王承芳, 陳娟, 曠文豐, 等. 復合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病的效果研究[J]. 生物災害科學, 2015, 38(4): 333-338.

[21] 陳志誼, 劉郵洲, 劉永鋒, 等. 拮抗細菌菌株之間的互作關系及其對生物防治效果的影響[J]. 植物病理學報, 2005, 35(6): 539-544.

Efficacy of the Formulation with CombinedStrains Against Strawberry Wilt

GAN Hua-lei, WANG Cheng-fang, HAO Wen-juan, YE Nai-wei, MAO Wei-li*

(Shanghai WLH Biotech Corp., Shanghai 200000, China)

A wettable powder (WP) formulation with single, 2 or 3 combined strains ofspp. (Tr14, Tr25, Tr85）was made and used for an indoor and field bioassays to test their efficacy on strawberry wilt caused byf. sp. fra-gariae. The results of the indoor bioassay showed that there were no significant differences in the incidence of the disease (, %) and the efficacy rate of disease control (, %) over the strawberry seedlings treated with 3 combined strains (Tr14+Tr25+Tr85, TM3) WP 200 T, 30% carbendazim WP 1 500 T and 2 combined strain (Tr14+Tr85) WP 200 T. However, they were significantly（≤0.05）lower (,%) or higher (,%), respectively, than those treated with single strain WP 200 T, other 2 combined strains WP 200 T and blank control. TM3 WP continued to be used for field efficacy trials in Shanghai, Beijing, Fujian and Chongqing in 2016 and 2017, respectively. The results showed that the values ofandof the strawberry seedlings treated with TM3 WP at 100 T, 200 T and 50% carbendazim WP 1 500 T were significantly（≤0.05）lower or higher, respectively, than those treated with TM3 WP 400 T, bacillus subtilis 1 000 T and blank control.

spp.;f.sp. fra-gariae; biological control; preventing efficacy

S476

A

2095-3704（2019）01-026-06

10.3969/j.issn.2095-3704.2019.01.05

2018-12-24

防治草莓多種病害新型微生物農藥/菌肥的研發(fā)與應用（16391902400）

干華磊（1987—），男，農藝師，主要從事生物農藥的研發(fā)與技術推廣，hlgan1026@163.com；

毛偉力，博士，weilimao@hotmail. com。

干華磊, 王承芳, 郝文娟, 等. 復合木霉菌制劑防治草莓苗枯萎病的研究[J]. 生物災害科學, 2019, 42(1): 26-31.