甜菜塊根和玉米秸稈混貯營養(yǎng)品質(zhì)及有氧暴露期微生物數(shù)量分析

周 瑞， 劉立山， 郎 俠， 王彩蓮， 宋淑珍， 吳建平*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 甘肅 蘭州730070； 2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所， 甘肅 蘭州 730070)

飼用甜菜(BetavulgarisL.var.iutea Dc.)是藜科甜菜屬2年生草本植物，甜菜栽培種的一個變種，其塊根中碳水化合物、粗蛋白、鈣磷及微量元素含量高，粗纖維含量低，營養(yǎng)價值較平衡全面、適口性好、易被家畜消化利用[1]，在丹麥、德國、荷蘭等歐洲發(fā)達(dá)國家，普遍采用飼用甜菜飼喂奶牛[2]，但新鮮飼用甜菜因含水量高達(dá)90%以上，保存時會因為水分流失而造成營養(yǎng)物質(zhì)流失[3]，容易腐爛變質(zhì)，另外，飼喂時切碎麻煩，直接保存占空間大，不易長時間保存。限制了其種植面積及在畜牧飼養(yǎng)中的廣泛利用。玉米(Zeamays)秸稈青貯是北方目前來源最廣泛、應(yīng)用最普遍的一種反芻動物飼料，但由于去穗玉米秸稈青貯粗蛋白(crude protein，CP)含量低，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量高，營養(yǎng)品質(zhì)較差。為了改善青貯的營養(yǎng)品質(zhì)，不同農(nóng)作物秸稈的混合青貯已經(jīng)是目前研究的重點。黃曉輝等[4]研究表明，將苦豆子(Sophoraalopecuroides)和玉米秸稈按照20∶80的混合比例青貯，使混貯料pH顯著降低，粗蛋白含量比玉米單貯增加了52.98%；王林等[5]研究表明，紫花苜蓿(Medicagosativa)和玉米秸稈按照30∶70的混合比例青貯時，pH值較苜蓿單貯顯著降低，而NDF和ADF含量低于玉米單貯，高于苜蓿單貯。大量研究表明[6-9]，按照不同秸稈的營養(yǎng)品質(zhì)特性進(jìn)行混合青貯可以改善青貯的營養(yǎng)品質(zhì)。然而青貯飼料在開窖后的有氧穩(wěn)定性也是影響青貯品質(zhì)的重要因素[10-12]，青貯飼料因接觸空氣容易發(fā)生二次發(fā)酵使腐敗菌大量繁殖，微生物菌群發(fā)生變化，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物的改變，同時也會造成青貯飼料營養(yǎng)物質(zhì)損失。因此，混合青貯時，不僅要考慮不同秸稈的營養(yǎng)品質(zhì)特性，實現(xiàn)營養(yǎng)互補，而且要便于貯存，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，減少營養(yǎng)物質(zhì)損失。目前，飼用甜菜主要以青飼為主，青貯利用研究較少，因此，為了更好地實現(xiàn)飼用甜菜的長期保存，減少營養(yǎng)物質(zhì)流失，本研究將飼用甜菜塊根和玉米秸稈按照不同比例進(jìn)行混合青貯試驗，測定混合青貯的營養(yǎng)品質(zhì)及有氧暴露期微生物數(shù)量的變化，篩選最優(yōu)的混合青貯比例，實現(xiàn)飼用甜菜的有效利用以及長期保存。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選擇蠟熟期收割的去穂玉米秸稈(豫玉22號，定西市臨洮縣八里鋪鎮(zhèn)種植)，留茬高度10～15 cm；甜菜(甜飼一號，武威市黃羊鎮(zhèn)種植)；小型攪拌機(JZC300型，山東省商河縣三星機械廠)；青貯發(fā)酵桶由20 L圓形旋蓋式聚乙烯塑料桶改造而成，桶蓋加裝單向排氣閥裝置(Kartell,cod:418，意大利)；秸稈粉碎機(9Z-9A型青貯鍘草對輥揉搓型，洛陽四達(dá)農(nóng)機有限公司生產(chǎn))。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)計5個處理，將甜菜塊根和玉米秸稈按照不同鮮重(fresh matter，F(xiàn)M)比例：0∶100，10∶90，20∶80，30∶70，40∶60混合成青貯飼料。試驗設(shè)計如表1所示。

表1 試驗設(shè)計Table1 The design of experiment

1.3 青貯調(diào)制

將收割后的玉米秸稈粉碎至1.5～2 cm，飼用甜菜粉碎至1～2 cm的小塊，按照不同鮮重比例使用小型攪拌機將青貯原料混合均勻，人工裝填到20 L的自制青貯發(fā)酵桶中，用腳最大限度的確保每桶青貯原料被壓實壓緊，并用膠帶密封桶蓋，記錄密封后每個青貯桶的重量，標(biāo)記后于室溫(15～25℃)避光保存，每組制作15桶，發(fā)酵50天。每組隨機選取3桶采樣，測定化學(xué)成分、發(fā)酵參數(shù)并計算干物質(zhì)損失率；第50 d模擬開窖，打開剩余的青貯桶，同時在發(fā)酵桶模擬開窖后第0，1，3，7 d隨機選取3桶采樣，分別檢測微生物數(shù)量。

1.4 測定方法

采樣前后記錄每個青貯桶的重量，采樣時，去掉青貯桶最上層5 cm和最底層5 cm的青貯飼料，均勻混合后，按梁瑜等[13]的幾何采樣法取樣。按照青貯桶青貯前后重量和干物質(zhì)含量計算干物質(zhì)損失率，干物質(zhì)損失率(%)=(原料重×原料DM%-青貯重×青貯DM%)/原料重×原料DM%。

青貯飼料中的干物質(zhì)含量(dry matter，DM)、粗蛋白、鈣(calcium,Ca)、磷(phosphorus,P)按照張麗英[14]的方法測定；酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量采用Van Soest等[15]的方法測定；水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)含量測定采用蒽酮比色法[16]；青貯飼料中NH3-N含量使用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[17]；pH值用pH211型精密pH計(HAN-NA)測定，乳酸和乙酸含量使用高效液相色譜法測定[18](Waters ACQUITY UPLC，色譜柱BEH C18 1.0×5.0 mm,1.7 μm，流動相為水和0.3%磷酸甲醇，流速為0.1 mL·min-1，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量5 μL)；微生物數(shù)量采用平板計數(shù)法[19]進(jìn)行計數(shù)，酵母菌、霉菌、乳酸菌分別用高鹽察氏培養(yǎng)基、麥芽糖浸粉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、MRS (de man rogosa sharpe) 培養(yǎng)基。

1.5 統(tǒng)計分析

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS Statistic19.0軟件包進(jìn)行方差分析和LSD/DUNCAN多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料的化學(xué)成分

青貯原料化學(xué)成分見表2，甜菜塊根DM、NDF、ADF含量顯著低于玉米秸稈(P<0.05)，而CP、WSC、Ca、P含量顯著高于玉米秸稈(P<0.05)。

表2 青貯原料的化學(xué)成分Table 2 Chemical composition of ensiling material

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different lowercase letters in the same row indicate significant differences at the 0.05 level,the same as below

2.2 不同比例混貯前化學(xué)成分及裝填密度

不同處理青貯前的化學(xué)成分見表3，隨著甜菜塊根添加比例的增加DM、NDF、ADF含量逐漸降低，而CP、WSC、Ca、P含量逐漸升高。裝填壓實后，其密度也隨甜菜塊根添加比例的增加而降低，且T3、T4組裝填密度顯著低于T0、T1、T2組(P<0.05)。

表3 不同比例混貯前化學(xué)成分Table 3 Chemical composition before mixed-ensiling with different ratio

2.3 不同比例混貯后化學(xué)成分及干物質(zhì)損失率

不同處理青貯的化學(xué)成分見表4，隨著甜菜根比例的增加，青貯后DM、NDF、ADF含量逐漸降低，而CP、WSC、Ca、P含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。T2組CP、Ca和P的含量分別為6.07%，0.46%和0.19%均顯著高于T0、T3、T4組(P<0.05)，而和T1組無顯著差異；T2組WSC含量顯著高于其他4組(P<0.05)，T1、T2組干物質(zhì)損失率均顯著低于其他三組(P<0.05)，且分別比T0組低3.06%，2.01%，T3、T4組干物質(zhì)損失率顯著高于T0組(P<0.05)，T4組干物質(zhì)損失率(17.67%)最高。

表4 不同比例混貯后化學(xué)成分及干物質(zhì)損失率Table 4 Chemical composition and dry matter loss after mixed-ensiling with different ratio

2.4 不同比例混貯后發(fā)酵品質(zhì)

不同處理青貯的發(fā)酵品質(zhì)見表5，青貯處理后，T2組pH顯著低于其他4組(P<0.05)，且T0、T1、T2組pH均在4.0以下，而T3、T4組pH大于4.0；T2組乳酸含量顯著高于其他4組(P<0.05)；T1組乙酸含量最低，其次是T2組，T4組乙酸含量最高；T1、T2組乙酸含量顯著高于T3、T4組；T0、T1組均未檢測到丙酸和丁酸的含量，T2組未檢測到丙酸含量，但丁酸含量顯著低于T3、T4組(P<0.05)；當(dāng)甜菜塊根的添加比例大于20%時，隨著甜菜根塊比例的增加NH3-N含量逐漸降低，且T2組NH3-N含量最低，但當(dāng)甜菜塊根的添加比例大于20%時，NH3-N含量逐漸升高，T4組NH3-N含量最高。

表5 不同比例混貯后發(fā)酵品質(zhì)Table 5 Fermentation quality after mixed-ensiling with different ratio

注：ND表示未檢測到

Note：ND indicate not detected

2.5 不同比例混貯有氧暴露期微生物數(shù)量

有氧暴露期微生物數(shù)量變化見表6，模擬開窖當(dāng)天，T2組酵母菌數(shù)量最低，且顯著低于T0、T3、T4組(P<0.05)，與T1組無顯著差異；除T4組霉菌數(shù)量顯著高于T3組(P<0.05)外，其他3組均未檢測到霉菌；T2組乳酸菌數(shù)量顯著高于其他4組(P<0.05)。有氧暴露期，各處理組酵母菌和霉菌數(shù)量均呈現(xiàn)上升趨勢，乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)降低趨勢，T3、T4組酵母菌和霉菌數(shù)均高于其他3組，而乳酸菌數(shù)低于其他3組；T2組在有氧暴露第1天時檢測到霉菌數(shù)量為2.36 Lg cfu·g-1，乳酸菌數(shù)量明顯下降，且低于T0、T1組；T0、T1組在有氧暴露第3天時檢測到霉菌數(shù)量分別為2.26，2.38 Lg cfu·g-1，之后逐漸升高，有氧暴露第7天時霉菌數(shù)量達(dá)到最大；有氧暴露第7天時，T1組乳酸菌數(shù)量最高，酵母菌和霉菌數(shù)量最低，T4組乳酸菌數(shù)量最低，酵母菌和霉菌數(shù)量最高。

表6 不同比例混貯有氧暴露期微生物數(shù)量Table 6 Microbial quantity during aerobic exposure in mixed-ensiling with different ratio/Lg cfu·g-1

3 討論

碳水化合物含量和水分是青貯過程中的關(guān)鍵因素，在青貯發(fā)酵中WSC為微生物發(fā)酵提供營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是乳酸菌繁殖發(fā)酵的基質(zhì)，適宜的WSC和水分含量，可確保乳酸菌快速地、大量地形成乳酸，促使pH迅速下降，有效地抑制不良發(fā)酵和蛋白質(zhì)的降解，有利于調(diào)制優(yōu)良青貯。NDF和ADF是反映動物消化率的重要指標(biāo)，ADF含量越低，飼草的消化率越高，飼用價值越大[20-22]。本研究中，甜菜塊根的含水量和WSC含量較高，而去穂玉米秸稈含水量和WSC含量則較低，他們混合可以互補不足，并且混合后各處理組原料化學(xué)成分均介于兩種原料之間，有效地保存和利用甜菜的飼用價值?；旌锨噘A飼料DM、NDF和ADF含量隨著甜菜根塊比例的增加逐漸降低。這主要是甜菜的DM、NDF和ADF含量較低，兩者混合產(chǎn)生了互補效應(yīng)。田瑞霞等[23]在紫花苜蓿青貯試驗中發(fā)現(xiàn)，青貯初期由于細(xì)胞呼吸以及酶解過程會消耗WSC，從而使NDF升高。而這與本研究結(jié)果相反，其原因可能是甜菜原料NDF(19.24%)、ADF(10.21%)含量較低，與玉米秸稈混合后其互補效應(yīng)占主導(dǎo)作用。當(dāng)甜菜塊根的添加比例小于20%時，WSC、CP、Ca和P含量隨著甜菜塊根比例的增加而升高，NH3-N含量逐漸降低，但當(dāng)甜菜塊根的添加比例大于20%時，WSC、CP、Ca和P含量隨著甜菜塊根比例的增加而降低，NH3-N含量逐漸升高，干物質(zhì)損失率也顯著升高。Broderick等[21]在苜蓿青貯時發(fā)現(xiàn)，苜蓿水分含量增加，DM含量降低，在青貯制作時，容易出現(xiàn)排汁的現(xiàn)象，營養(yǎng)成分易流失，水分越高，營養(yǎng)物質(zhì)流失越嚴(yán)重。李真真等[24]在苜蓿青貯時發(fā)現(xiàn)，水分過高，會因為排汁或者腐敗而難以獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料，隨著原料水分含量的下降，其WSC和CP含量也略微降低。王旭哲等[25]研究表明，不同的壓實程度對青貯的營養(yǎng)品質(zhì)影響不同，壓實程度越低，越容易氧化腐敗，CP降解加快，NH3-N含量升高，乳酸含量降低，F(xiàn)ransen等[26]也指出，對于過高的水分飼料，吸收劑的加入能減少汁液的流失，從而降低養(yǎng)分的流失，提高青貯的營養(yǎng)品質(zhì)。張薇薇等[27]研究表明，甜菜渣里添加不同吸收劑之后，可以降低蛋白質(zhì)的降解，DM損失率差異顯著(P<0.05)。由此推斷，本研究結(jié)果可能與甜菜塊根的含水量以及壓實程度有關(guān)，甜菜塊根添加比例過高時，由于甜菜塊根自生比較柔軟，人工裝填時不易踩實排出空氣，因此在發(fā)酵過程中有氧發(fā)酵會消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，CP降解加快，NH3-N含量升高，乳酸發(fā)酵受到抑制，同時干物質(zhì)損失嚴(yán)重，這與本研究中裝填密度逐漸降低相一致。另外，營養(yǎng)物質(zhì)也會隨著踩壓時水分的排出而流失。

青貯的發(fā)酵品質(zhì)與裝填的壓實程度有直接關(guān)系，青貯的壓實不足可能會導(dǎo)致有氧腐敗，填壓緊實的青貯窖有助于pH的降低以及厭氧條件的形成青貯發(fā)酵過程中，高緊實度的青貯可以減少氧氣的滲入，進(jìn)而降低空氣中以及飼料作物表面附著的好氧微生物的活性，對青貯微生物群落組成和有氧穩(wěn)定性均有重要影響[28]。本研究結(jié)果表明，添加20%的甜菜塊根時，pH分別顯著低于未添加和添加10%甜菜塊根組，乳酸含量顯著高于未添加和添加10%甜菜塊根組，在未添加、添加10%，20%甜菜塊根組中均未檢測到丁酸的存在，這也表明其青貯品質(zhì)較好。當(dāng)甜菜塊根的添加比例大于20%時，一方面會使水分含量過高，不利于青貯成功，另一方面不利于青貯的壓實排出空氣，抑制乳酸的發(fā)酵，加速了有氧微生物的活動，蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)被消耗利用，pH、丁酸、NH3-N含量增加，青貯發(fā)酵品質(zhì)降低。Yahaya等[29]研究發(fā)現(xiàn)，中、低水分青貯與高水分青貯相比，pH值呈顯著下降趨勢(P<0.05)，乳酸含量呈極顯著增加趨勢(P<0.01)，乙酸含量有明顯增加，低水分牧草青貯未檢測出丁酸，這表明中、低水分青貯無不良發(fā)酵產(chǎn)生，牧草青貯的發(fā)酵品質(zhì)得到改善。Shin等[30]在對甜菜渣青貯的研究中發(fā)現(xiàn)，向甜菜渣中添加玉米秸使得青貯飼料水分減少，丁酸產(chǎn)產(chǎn)量降低，可以防止青貯飼料的腐敗變質(zhì)。因此，本研究中添加低于20%的甜菜塊根時，有利于對水分的吸附，以及裝填時壓實程度，改善混貯的發(fā)酵品質(zhì)。

乳酸菌是青貯飼料發(fā)酵過程中最為關(guān)鍵的細(xì)菌，也是乳酸發(fā)酵的驅(qū)動者[31]。由于在開窖后接觸到氧氣，好氧微生物開始大量繁殖，從而導(dǎo)致青貯飼料不穩(wěn)定，具體表現(xiàn)為溫度增加、剩余WSC含量急劇下降和pH上升[27]，其有氧環(huán)境不適于乳酸菌繼續(xù)生長，致使乳酸菌數(shù)量開始緩慢下降，乳酸含量減少[32]。Cavallarin等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在集約化養(yǎng)殖場青貯開窖15天后，青貯飼料表層就會有霉菌生長并出現(xiàn)黃曲霉毒素。因此，霉菌的出現(xiàn)是青貯飼料發(fā)霉變質(zhì)的開始，王旭哲等[25]研究發(fā)現(xiàn)，開窖后好氧細(xì)菌均會有不同程度的增加，開窖后青貯飼料接觸到氧氣，好氧細(xì)菌利用WSC快速繁殖，進(jìn)一步加劇好氧變質(zhì)，隨著pH的逐漸升高好氧細(xì)菌數(shù)量增加，乳酸含量逐漸降低，霉菌數(shù)量均有不同程度的增加，Shi[34]和Spadaro等[35]也有相似的研究結(jié)果。本研究在模擬開窖當(dāng)天，添加20%甜菜塊根組乳酸菌含量最高，酵母菌含量最低，霉菌未檢測到，添加30%和40%甜菜塊根組均檢測到霉菌，含量分別為2.53 Lg cfu·g-1和2.74 Lg cfu·g-1，這也表明添加30%和40%甜菜塊根組可能會有霉變腐敗現(xiàn)象，之后隨著有氧暴露時間的延長各處理組酵母菌和霉菌數(shù)量總體呈上升趨勢，乳酸菌數(shù)量呈降低趨勢，這與王旭哲[24]和Tabacco等[32]的研究結(jié)果一致。有氧暴露第3天后，添加20%，30%，40%甜菜塊根組酵母菌和霉菌數(shù)量均顯著高于未添加組和添加10%組，而乳酸菌數(shù)量顯著低于未添加組和添加10%組。由以上結(jié)果可以推斷出，隨著甜菜塊根比例的增加，由于甜菜自生柔軟且水分較高，人工裝填踩實時，壓實程度會越差，裝填密度降低。在開窖前，由于密封條件下，壓實程度對添加20%的甜菜塊根組和添加10%的甜菜塊根組的影響不明顯，這也與他們干物質(zhì)損失率不顯著相吻合，但在模擬開窖后，空氣不斷進(jìn)入青貯桶內(nèi)，同時20%的甜菜塊根組WSC含量顯著高于添加10%的甜菜塊根組，充足的WSC刺激了酵母菌、霉菌的生長，并為其提供了生長繁殖的能量[36]，霉變速率加快，酵母菌、霉菌大量繁殖，pH升高，乳酸發(fā)酵受到抑制。因此，開窖后有氧腐敗是影響青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)鍵因素，同時也決定了青貯飼料是否能夠長期保存與利用。

4 結(jié)論

本試驗在將玉米秸稈和甜菜塊根按照不同混合比例青貯時，對青貯品質(zhì)及有氧暴露期微生物數(shù)量影響顯著。在青貯飼料密封發(fā)酵期，未添加組、添加10%，20%甜菜塊根組青貯營養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì)均優(yōu)于其他兩組，但是在開窖后有氧暴露期，添加20%甜菜塊根組氧化腐敗速率較未添加組、添加10%快，不易長期保存利用，而添加10%甜菜塊根組更加穩(wěn)定，在生產(chǎn)實踐中更有利于甜菜營養(yǎng)品質(zhì)的長期保存利用。