納他霉素的大孔樹脂原位吸附動(dòng)力學(xué)研究

鄭迎瑩 王大紅,2 徐 鵬 沈文浩 張 穎

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023;2.河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

食品在貯存中容易引起腐敗變質(zhì)，添加食品防腐劑是食品保藏的有效手段，近年來，天然防腐劑的研究與使用逐漸吸引了人們的注意力，并已成為食品保藏研究的熱點(diǎn)[1-2]。納他霉素是由納塔爾鏈霉菌等鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種二十六元多烯大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)，對幾乎所有的霉菌和酵母菌都具有抗性，并能抑制真菌毒素的產(chǎn)生[3]，具備高效、安全、穩(wěn)定性高等優(yōu)良性質(zhì)，有著巨大的應(yīng)用前景和生產(chǎn)價(jià)值，到目前為止已被全球大多數(shù)國家批準(zhǔn)作為食品防腐劑使用[4]。納他霉素的生產(chǎn)主要采用發(fā)酵法，由于納他霉素的產(chǎn)量較低，工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)展緩慢，導(dǎo)致價(jià)格較高，目前其主要集中應(yīng)用于高附加值的產(chǎn)品中[5]。

納他霉素是胞內(nèi)產(chǎn)物，在其生物合成過程中，由于菌體細(xì)胞和胞內(nèi)的酶都受到高濃度產(chǎn)物納他霉素的反饋抑制作用，使得生物細(xì)胞及酶的潛力不能充分發(fā)揮，導(dǎo)致納他霉素的產(chǎn)率和原料的轉(zhuǎn)化率難以提高。目前，有關(guān)納他霉素的研究[6-7]多集中在采用菌株選育、發(fā)酵條件和工藝優(yōu)化、代謝調(diào)控等方式提高發(fā)酵產(chǎn)量上，而在發(fā)酵產(chǎn)物分離和產(chǎn)物抑制等方面研究較少。原位分離技術(shù)是一種將生物合成與目標(biāo)代謝產(chǎn)物分離相耦合的技術(shù)，已受到中國研究者的重視，該技術(shù)可選擇性地從發(fā)酵液中連續(xù)分離有抑制性或者有毒性的代謝產(chǎn)物，不僅能夠減弱終產(chǎn)物的反饋抑制作用，同時(shí)還能提高產(chǎn)物的回收率，減少有機(jī)溶劑的使用，其中采用大孔吸附樹脂的原位分離技術(shù)應(yīng)用較為廣泛[8]。大孔吸附樹脂是一種不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物，是一種新型分離材料，已廣泛應(yīng)用到天然產(chǎn)物的提取分離、藥物、環(huán)境保護(hù)等方面[9]。目前，大孔吸附樹脂已被用于納他霉素的純化中，如魏寶東等[10]采用甲醇做溶劑，從發(fā)酵液中提取納他霉素，然后采用D101大孔吸附樹脂進(jìn)一步純化，回收率為82.12%，純度為 91.2%；但到目前為止，還未見采用大孔樹脂原位吸附的方法弱化或移除發(fā)酵過程中納他霉素的反饋來提高納他霉素產(chǎn)量的報(bào)道。該技術(shù)在其他微生物源代謝產(chǎn)物的發(fā)酵過程中已被廣泛使用，如：在普那霉素發(fā)酵過程中添加JD-1大孔樹脂能吸附發(fā)酵液中90%的普那霉素，使普那霉素的發(fā)酵產(chǎn)量從0.29 g/L提高到1.03 g/L[11]；在琥珀酸發(fā)酵過程中加入40 g/L D301R 樹脂，至發(fā)酵終點(diǎn)琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到49.46 g/L，相比普通發(fā)酵過程，底物轉(zhuǎn)化率提高了21%[12]。試驗(yàn)采用StreptomycesnatalensisHW-2為納他霉素生產(chǎn)菌株，以建立納他霉素的發(fā)酵和分離耦合體系為目的，通過篩選對納他霉素具有良好吸附效果的大孔吸附樹脂，探討大孔吸附樹脂原位分離技術(shù)發(fā)酵納他霉素的可行性，并對這一過程的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行研究，獲得最佳工藝參數(shù)，為納他霉素的生產(chǎn)和分離提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)HW2：實(shí)驗(yàn)室保藏；

HPD100、HPD300、HPD450和HPD600大孔樹脂：滄州寶恩公司；

D101大孔樹脂：海光化工有限公司；

AB-8大孔樹脂：天津南大樹脂科技有限公司；

XAD-16HP大孔樹脂：美國羅門哈斯公司；

NKA和HZ816大孔樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司；

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，麥芽浸粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.2；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，麥芽浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.2；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母浸膏2 g/L，牛肉膏10 g/L，pH 7.2；

甲醇：分析純，天津德恩化學(xué)試劑有限公司；

甲醇：色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司；

葡萄糖：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

分析天平：ME104E /02型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 斜面上生長成熟的孢子制成孢子懸液，按照體積分?jǐn)?shù)2%的比例接種于種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；將培養(yǎng)好的種子液按體積分?jǐn)?shù)6%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)120 h。

1.2.2 納他霉素的提取 取發(fā)酵液與甲醇按體積比1∶9比例混合，28 ℃、180 r/min振蕩解吸2 h，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，得待測液；取出樹脂，洗滌過濾，晾干，放入發(fā)酵液等體積的甲醇中，解吸(方法同上)，10 000 r/min離心10 min，得到待測樣品。

1.2.3 納他霉素含量的測定 采用高效液相色譜法，液相條件為：YMC-Pack ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)，流動(dòng)相為甲醇—水(體積比75∶25)，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min，檢測波長304 nm。

1.2.4 大孔樹脂預(yù)處理 參照文獻(xiàn)[13]。

1.2.5 大孔樹脂含水量測定 試驗(yàn)用樹脂為干樹脂，稱取預(yù)處理過的大孔樹脂10 g，60 ℃烘至恒重，并按照文獻(xiàn)[13]的方法計(jì)算各樹脂的含水量。不同樹脂的物理性質(zhì)及含水量見表1。

表1 不同樹脂的性質(zhì)和含水量

1.2.6 靜態(tài)吸附試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[14]修改如下：取預(yù)處理過的干樹脂各2 g，分別加入裝有30 mL 50 mg/L納他霉素水溶液的三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩吸附12 h。取0.2 mL上清液加1.8 mL甲醇，0.22 μm微孔濾膜過濾，測定納他霉素的含量，分別根據(jù)式(1)、(2)計(jì)算樹脂吸附量及吸附率。

(1)

(2)

式中：

Q——吸附量，mg/g干樹脂；

C0——納他霉素初始質(zhì)量濃度，g/L；

C1——吸附后溶液中納他霉素質(zhì)量濃度，g/L；

V——溶液體積，mL；

m——大孔樹脂質(zhì)量，g；

η——吸附率，%。

1.2.7 靜態(tài)解吸試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[15]修改如下：選用甲醇作為納他霉素的解吸劑，將充分吸附的大孔樹脂過濾，用去蒸餾水沖洗后濾干置于裝有30 mL甲醇的150 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩12 h，取樣并測定解吸液中納他霉素含量，根據(jù)式(3)計(jì)算解吸率。

(3)

式中：

W——解吸液中納他霉素質(zhì)量濃度，mg/L；

Q——吸附總量，mg；

V——解吸液總體積，L；

η′——解吸率，%。

1.2.8 靜態(tài)吸附等溫曲線的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[16]修改如下：配置濃度為30，50，70，90，110，130，150 mg/L的納他霉素溶液各30 mL，分別置于裝有2 g大孔樹脂的250 mL 三角瓶中，25 ℃、120 r/min振蕩吸附2 h。取出充分吸附的大孔樹脂置于裝有30 mL甲醇的250 mL三角瓶中180 r/min、25 ℃解吸2 h，測定納他霉素含量，以初始濃度(mg/L)對平衡后吸附量(mg/g干樹脂)做圖，可得到納他霉素的吸附等溫線。

1.2.9 大孔樹脂原位發(fā)酵工藝的優(yōu)化 根據(jù)以上優(yōu)化得到的最佳大孔吸附樹脂，固定發(fā)酵條件，選擇樹脂添加量和添加時(shí)間作為影響納他霉素產(chǎn)量的主要因素，進(jìn)行納他霉素發(fā)酵和大孔樹脂原位吸附過程耦合，根據(jù)大孔樹脂中納他霉素的質(zhì)量濃度選取最佳工藝條件。

(1)樹脂添加量：按照初始發(fā)酵條件，將培養(yǎng)好的種子液按體積分?jǐn)?shù)6%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)120 h，樹脂添加量分別設(shè)為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 g/30 mL，樹脂在發(fā)酵開始時(shí)加入，進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，取出大孔樹脂，將大孔樹脂解吸12 h，測定納他霉素質(zhì)量濃度。

(2)樹脂添加時(shí)間：按照初始發(fā)酵條件，將培養(yǎng)好的種子液按體積分?jǐn)?shù)6%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)120 h，選用最佳樹脂添加量，樹脂添加時(shí)間分別設(shè)為24，36，48，60，72 h進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，取出大孔樹脂，將大孔樹脂解吸12 h，測定納他霉素質(zhì)量濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和圖表繪制均采用 Origin 2017 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的靜態(tài)吸附與解吸

大孔吸附樹脂主要靠其大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積對溶液中的溶質(zhì)進(jìn)行吸附。在模擬發(fā)酵過程，對9種大孔吸附樹脂進(jìn)行模擬原位吸附分離，通過測定樹脂吸附和解吸前后溶液中納他霉素的濃度，計(jì)算各樹脂的吸附量、吸附率和解吸率。如表2所示，9種樹脂對納他霉素均具有吸附作用，其中HPD600、HZ816和AB-8對納他霉素的吸附量、吸附率和解吸率較低；HPD100、HPD450和XAD-16HP樹脂對納他霉素的吸附量均達(dá)到了0.71 mg/g干樹脂以上，但HPD100和XAD-16HP樹脂的解吸率相對較低；弱極性樹脂HPD300吸附率較HPD450低，但解吸率最高達(dá)到了95.22%，說明HPD300和HPD450樹脂與納他霉素的極性相似。綜合考慮樹脂的吸附率、解吸率和吸附量，選用HPD300和HPD450兩種樹脂進(jìn)行下一步研究。

表2 不同樹脂對納他霉素的吸附率、解吸率及吸附量

Table 2 Adsorption rate, desorption rate and adsorption capacity of natamycin by different resins

樹脂名稱吸附量/(mg·g-1DryResins)吸附率/%解吸率/%HPD1000.7295.7173.01HPD3000.6383.4795.22HPD6000.5573.8282.56D1010.6991.9386.45HPD4500.7296.1485.42AB-80.5471.8588.09NKA0.6992.3275.59HZ8160.6384.3872.85XAD-16HP0.7194.5081.75

2.2 樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

以吸附率為縱坐標(biāo)，吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，得到HPD300和HPD450兩種樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。從圖1可以看出，HPD300和HPD450兩種樹脂在0.5～2.0 h時(shí)吸附率逐漸增大，2 h后樹脂對溶液中納他霉素的吸附率變化不大，4 h以后吸附率隨時(shí)間變化基本上達(dá)到吸附平衡，HPD450型樹脂吸附率較大，達(dá)到了96.14%，而HPD300樹脂吸附率為85.42%，表明這兩種樹脂對納他霉素的吸附是快速平衡型。

2.3 樹脂的靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線

采用甲醇對上述兩種達(dá)到吸附平衡的樹脂進(jìn)行解吸，每20 min測定解吸液中納他霉素的濃度，連續(xù)測定160 min，以樹脂的解吸率為縱坐標(biāo)，解析時(shí)間為橫坐標(biāo)，得到HPD300和HPD450樹脂的靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線。從圖2中可以看出，HPD300和HPD450樹脂都在起始階段對納他霉素的解吸率變化幅度較大，2.0 h后解析率變化幅度較小，HPD450樹脂在4.5 h時(shí)達(dá)到最大87.25%，而HPD300樹脂在5.0 h時(shí)達(dá)到最大95.36%，解吸液中納他霉素的質(zhì)量濃度基本不變，但是由于樹脂物理性質(zhì)各方面的差異，HPD300樹脂解吸率比HPD450樹脂高出8.11%。綜合以上研究結(jié)果，HPD450樹脂的吸附率和解吸附率的整體效果比HPD300更佳，為最優(yōu)選擇樹脂，進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖2 靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線

2.4 樹脂的靜態(tài)吸附等溫線

以HPD450樹脂為研究對象，以納他霉素的起始質(zhì)量濃度對平衡后的吸附量作圖，可得到納他霉素的質(zhì)量濃度<150 mg/L時(shí)的吸附等溫線。如圖3所示，溫度為25 ℃時(shí)，隨著納他霉素初始濃度的增加，HPD450樹脂的吸附量也隨之增加。吸附過程是溶質(zhì)分子在吸附劑與溶劑兩相界面上進(jìn)行分配的過程，在一定溫度下，當(dāng)吸附過程達(dá)到平衡時(shí)，溶質(zhì)分子在液相和固相中的濃度關(guān)系可用吸附等溫方程式來表示，常用的是Langmuir模型和Freundlich模型。Langmuir模型是假設(shè)大孔樹脂表面為單層吸附、被吸附物質(zhì)均勻分布、物質(zhì)在大孔樹脂的表面沒有分子相互作用；Freundlich模型為非理想狀態(tài)的吸附模型，該模型為單分子層吸附和非單層吸附行為，被用于化學(xué)吸附和物理吸附的過程中[17]。HPD450樹脂的靜態(tài)吸附等溫線的Langmuir和Freundlich擬合曲線中相關(guān)系數(shù)(R2)的值分別為0.996和0.957，兩者R2差別不大，但是Freundlich曲線的吸附強(qiáng)度<<1，說明HPD450樹脂的吸附更符合Langmuir模型，是單分子層吸附，最大吸附量為10.03 mg/g干樹脂。

圖3 HPD450樹脂的吸附等溫線

2.5 原位分離條件優(yōu)化

2.5.1 樹脂的添加量 比較了不同樹脂添加量的發(fā)酵—分離耦合工藝，HPD450樹脂在發(fā)酵開始時(shí)加入發(fā)酵液中，結(jié)果如圖4所示。在樹脂添加量為0.5～4.0 g/30 mL時(shí)，納他霉素的產(chǎn)量隨著樹脂添加量的增加而提高，當(dāng)樹脂的添加量為4.0 g/30 mL時(shí)，納他霉素的產(chǎn)量最高達(dá)1.15 g/L，比對照(0.83 g/L)提高了38.56%，隨著樹脂添加量的進(jìn)一步增加到5.0 g/30 mL時(shí)，而納他霉素的產(chǎn)量卻沒有明顯變化。從結(jié)果可以看出，在發(fā)酵—吸附分離耦合過程中，HPD450樹脂的添加可以有效提高納他霉素的發(fā)酵水平，并且使菌體內(nèi)的納他霉素維持在較低水平，降低了納他霉素的產(chǎn)物抑制作用，為底物的高效轉(zhuǎn)化提供了良好的基礎(chǔ)。王衛(wèi)等[18]報(bào)道在赤霉素發(fā)酵過程中，最佳D100樹脂的加入量為2%，過多的樹脂加入后，會(huì)影響菌絲生長，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量下降。

2.5.2 樹脂添加時(shí)間 在HPD450樹脂添加量為4 g/30 mL的條件下，考察加入時(shí)間對納他霉素原位吸附的影響。由圖5可知，在發(fā)酵后48 h添加時(shí)，納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量最高，達(dá)到1.38 g/L，與初始添加的相比，納他霉素的產(chǎn)量提高了27.78%，比不添加樹脂時(shí)提高了66.27%；發(fā)酵后60，72 h添加時(shí)，納他霉素的產(chǎn)量卻在下降。分析原因，在發(fā)酵前期以菌體生長為主，大孔樹脂的過早加入可能對納塔爾鏈霉菌的生長有一定的影響，進(jìn)而影響納他霉素的產(chǎn)生；加入過晚，產(chǎn)物抑制已經(jīng)形成，而且發(fā)酵液中的其他成分可能被大孔樹脂吸附，使其吸附容量變小，從而減少了納他霉素產(chǎn)量。徐浩等[19]報(bào)道在Nisin發(fā)酵過程中，D113樹脂加入過早在一定程度上影響細(xì)胞生長；而加入過晚，產(chǎn)物抑制已經(jīng)在一定程度上形成，從而導(dǎo)致Nisin產(chǎn)率也偏低。

圖4 發(fā)酵液中樹脂添加量對納他霉素合成的影響

Figure 4 Effect of resin addition content in fermentation broth on synthesis of natamycin

圖5 添加時(shí)間對納他霉素合成的影響

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，HPD450型大孔樹脂為納他霉素的最佳吸附劑，采用該大孔樹脂原位吸附分離耦合納他霉素的發(fā)酵，納他霉素產(chǎn)量提高明顯，優(yōu)化后比不添加樹脂時(shí)提高了66.27%，該結(jié)果也證實(shí)在納他霉素的發(fā)酵過程中存在產(chǎn)物反饋抑制現(xiàn)象；利用該大孔樹脂優(yōu)良的富集和解吸性能，可以大量減少在納他霉素提取過程中甲醇的使用，簡化發(fā)酵液預(yù)處理流程，從而提高納他霉素的得率。但目前納他霉素的發(fā)酵與樹脂吸附的耦合技術(shù)僅處于搖瓶試驗(yàn)階段，而且StreptomycesnatalensisHW-2在發(fā)酵過程中菌絲容易纏繞形成小球，導(dǎo)致大孔樹脂與菌絲無法有效分離，同時(shí)，HPD450型大孔樹脂還存在非特異性吸附現(xiàn)象，從而影響納他霉素的發(fā)酵和樹脂的使用效率，進(jìn)而導(dǎo)致該方法在納他霉素工業(yè)化應(yīng)用困難。因此，如何減少發(fā)酵過程中菌絲球的形成和開發(fā)易于從發(fā)酵體系中回收的新型大孔樹脂，提高耦合發(fā)酵中大孔樹脂的利用率，將是納他霉素生物合成與樹脂分離相耦合技術(shù)的進(jìn)一步研究方向。